酶分子改造工程.pptVIP

* 第2-4 酶分子改造工程 一 非理性设计 即——定向突变： 广义上指用不同的方法产生突变体库，在此基础上筛选含有需要功能的突变体的过程。 是在试管中模拟达尔文的进化论的关键过程，模仿大自然进化过程。 1）随即突变建立突变体库 正常PCR 因TaqDNA聚合酶没有3‘-5’外切酶活性，循环30次后，碱基错误率0.25%。 易错PCR (error-prone PCR) 加入Mn2+/Co3+，提高dNTP浓度，循环30次后，错误率达2%。 关键为控制突变率：太低,大多为野生型；太高，不利于发现突变株。 合适1.5-5%；PCR1-2%；error-PCR4-5%。 2) 重组方式建立突变体库 ① DNA改组（DNA shuffling) 一组基因序列被随机切断，用PCR重新组装成完整基因。 循环次数低有效。 ② 交错延伸PCR 　　交错延伸(stagger extension process, StEP)PCR是在PCR反应中把常规的退火和延伸合并为一步，缩短其反应时间（55℃，5s)，从而只能合成出非常短的新生链，经变性的新生链再作为引物与体系内同时存在的不同模板退火而继续延伸。此过程反复进行，直到产生完整的基因长度。 ③ 体外随即重估(RPR) 单链DNA模板和一套随机序列引物混合→引物互补模板的不同位点而产生有突变点的片段→ PCR（片段互为引物）合成有突变的全长DNA 。 ④ 瞬变模板的随机嵌合反应 　　为增加低同源性序列间的重组效率→ 用寡聚核苷酸链作为接头，代替低同源区→ 较短片段作为引物退火，产生完整合成的嵌合体。 ⑤ 突变和单向重组 PCR扩增或限制性内切酶将亲本基因随即片段化→片段化序列在单一方向引物（含特异性限制性位点）存在下进行重新组装→DNA片段进行凝胶电泳纯化，用T4聚合酶或S1核酸酶处理DNA端部→用引物特异性酶切。 ⑥其他方法（略） 二、理性设计 有目的突变酶分子的aa残基 有点：进行定位定向的人工改造，得到所需属性，不需高通量筛选。 方法： 1）定点突变 概念：以蛋白结构和功能的研究为基础，设计新蛋白的aa序列，应用重组DNA技术设计并构建具有新性质的蛋白或酶的过程。 2）融合蛋白和融合酶 例子：木聚糖酶，纤维素结合结构域（CBD)； 催化结构域。 CBD： 位于催化结构域的N、C端或中部，可增加酶在底物周围的 浓度，或通过非共价键破坏底物多糖，已增加酶的催化性。 融合：嗜碱性芽孢杆菌C-125产生的木聚糖酶无CBD结构； 融合CBD家族Ⅵ，CBD从梭状芽孢杆菌克隆出来。 融合过程如图2-2. 二者由连接肽连接 3）分子模拟与计算分析 理性设计的前提条件：清楚知道酶分子的三维结构、结构和功能的关系。 分子模拟不受理性条件限制： 主要用计算机技术、生物信息学、分子动力学等→进行蛋白质结构和分子设计 →从蛋白质序列、结构研究功能aa →理性设计突变点，并模拟突变酶的结构→分子对接研究酶与底物分子的相互作用；分子动力学模拟研究酶的性质。 三 理性设计与定向进化相结合 一般情况下：先进性蛋白质结构的计算机分析产生序列的多样性； 后用计算机模拟来检验序列的功能特性； 通过初步的筛选的序列进行合成和实验检验。 四 酶分子改造实例 1）提高没作用的pH 纤维素酶：212和140为aa为高度保守的氨基酸。 例子：重组PCR→纤维素酶Cel18-7 →定点突变： Asn212His,最适pH值6.0-6.5——6.5-7.0; His140Gln,最适pH值6.0-6.5——6.5-5.5。 2）酶热稳定性提高 -S-S-有助于耐热性。如研究发现，木聚糖酶110 -S-S- 154，嗜热。 2001年，Turunen, 木聚糖酶的α-螺旋N端的Asn154Cys;折叠片Ser110Cys