新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后海马神经细胞自噬检测及雷帕霉素对预后的干预分析-儿科学专业论文.docx

苏州大学学位论文独创性声明本人郑重声明:所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标明。本人承担本声明的法律责任。论文作者签名::1血日期:列川、oh、11\F?苏州大学学位论文使用授权声明本人完全了解苏州大学关于收集、保存和使用学位论文的规定，IiP:学位论文著作权归属苏州大学。本学位论文电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。苏州大学有权向国家图书馆、中国社科院文献信息情报中心、中国科学技术信息研究所〈含万方数据电子出版社〉、中国学术期刊〈光盘版〉电子杂志社送交本学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存和汇编学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。涉密论文口本学位论文属在一一一年一一月解密后适用本规定。非涉密论文d论文作者签名z齐习。日期:-)..QI小oby叮导师签名:九db日期:I\e-苟F矿....F--.........--.丰?一-二-ι14_=.吧-阜，==，二一← .....................，、----新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后海马神经细胞自噬检测及雷帕霉素对预后的干预中文摘要目的：研究新生大鼠缺氧缺血性脑损伤（Hypoxic-ischemicbraindamage，HIBD）后海马组织中神经元细胞的损伤情况，通过观察不同时间点及各组间细胞死亡、自噬相关蛋白的表达，初步探讨雷帕霉素对HIBD 后神经元存活的干预作用。方法：采用7日龄新生SD（SpragueDawley）大鼠，根据改良Rice-Vannucci 法建立HIBD模型。将新生大鼠随机分为雷帕霉素干预组（Ra组）、缺氧缺血组（HIBD 组）及假手术组（Sham组）。选取HIBD模型制成后0h、6h、12h、24h、48h及72h 六个时间点，通过Westernblot法测定海马组织中Cleavedcaspase-3、Beclin-1、LC3蛋白浓度的变化；采用免疫组织化学法染色观察海马组织Cleavedcaspase-3染色情况，结合HE染色及尼氏染色从细胞层面了解海马区域神经细胞发生缺氧缺血损伤后的转归情况，并探讨应用自噬激动剂雷帕霉素对其发挥的干预作用及可能机制。结果：1、HE染色结果：1.1Sham组脑组织海马区域6个时间点HE染色后光镜下观察：海马区域组织染色均匀、结构清晰，神经细胞形态正常，胞质染色为淡红色，胞核染色为蓝色；1.2 HIBD组脑组织HE染色后光镜下观察：缺氧缺血侧海马神经细胞变性及坏死的程度随时间的延长而加重，表现为海马区域组织结构紊乱、间质水肿，神经细胞肿胀甚至坏死，胞核出现深染、固缩、碎裂，核仁消失，伴有不同程度的炎性细胞浸润；1.3Ra组脑组织HE染色后光镜下观察：缺氧缺血侧海马神经细胞出现变性及部分神经细胞坏死，但程度及范围均较HIBD 组轻；2、Western-blot结果：2.1 Beclin-1蛋白：与Sham组相比，HIBD组该蛋白自0h起表达迅速升高，至24h 达高峰，且每个时间点表达均显著高于Sham组(P0.05)；与HIBD组相比，Ra组该蛋白表达趋势与HIBD 组一致，且每个时间点表达均高于HIBD 组，且具有统计I中文摘要新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后海马神经细胞自噬检测及雷帕霉素对预后的干预学意义(P0.05)；2.2LC3II：与Sham组相比，HIBD 组及Ra组的该蛋白表达在6个时间点的表达均高于Sham组，且具有统计学意义(P0.05)；HIBD组及Ra组该蛋白均从0h起开始上升，且Ra 组的表达在每个时间点均高于HIBD 组，除外12h这一时间点外，其它5个时间点均有统计学意义(P0.05)；2.3Cleavedcaspase-3蛋白：与Sham组相比，HIBD组及Ra组该蛋白的表达除0h无明显增加外，其余5个时间点均显著升高，且具有统计学意义(P0.05)；与HIBD 组相比，Ra组该蛋白表达在每个时间点均低于HIBD组，但只有6h 及12h具有统计学意义(P0.05)；3、Cleavedcaspase-3蛋白免疫组织化学染色结果：Sham组海马区域各个时间点染色均较浅；与HIBD组相比，Ra组染色仅在6h 及12h浅于HIBD组，且平均光密度值具有统计学意义(P0.05)，其余时间点两组无显著差异(P0.05)；4、尼氏染色结果：与Sham组相比，HIBD 组及Ra组每个时间点均存在不同程度的海马区域结构紊乱、神经细胞数量减少、细胞核碎裂、溶解及尼氏小体崩解及丢失，随时间延长而加重；