分子生物学DNA重组.pptVIP

第四章 DNA的重组 §3-1 引言 §3-2 同源重组 §3-3 位点特异重组 §3-4 转座重组 三、位点特异重组调节基因的表达 （二）复合转座子 (composite transposon) 二、转座子的类型及结构特征 （一）插入序列(insertional sequence, IS) 细菌的转座因子有两类：插入序列、复合转座子 是最简单的转座子，除转座所需基因外不携带任何标记基因。（它的存在只能借助插入位点有关基因的失活来判断，或者通过分子杂交和测序来检测。） 1.定义 2. 插入序列结构特征： （4）转座时往往复制宿主靶位点一小段（4-15bp）DNA，形成位于IS序列两端的正向重复区。 （1）它们都是小的DNA片段（约1kb ） （2）两端有反向重复序列（inverted repetitive sequence, IR） （3）除了IS1以外，所有已知IS序列都只有一个开放读码框，具有编码转座酶的基因。 2. 插入序列结构特征： 1.定义 除转座酶(transposase)基因外还携带各种标记基因，如带有抗药基因，因而易于检测其存在。 * §3-2 同源重组 （一）Holliday模型 二、同源重组的机制 1.同源配对 2.单链断裂 3.交换连接 4.分支移动 5.弯曲旋转 6.水平切割 6.垂直切割 7.连接 垂直切割方法的侧接杂螺旋区域的DNA是完全重组的，切开的链并非原来断裂的链. 水平切割方式其侧接(flanking)DNA是部分重组的，切开的链与原来断裂的是同一条链. 重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA，称为拼接重组体(splice recombinant)； 重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA，称为片段重组体(patch recombinant)。 异源双链(heteroduplex):通过DNA单链的侵入和DNA链的同化,被侵入的DNA双螺旋分子上有一段区域含有来自联会对方的一条链,它随着DNA链同化作用的继续进行而逐步扩大,这一区域叫做异源双链。 （二）双链断裂启动重组 1.同源配对,双链断裂 3.3端移至另一双螺旋 2.断裂在3端扩大成缺口 4.3端延伸,相对应的链 则被置换出来 5.置换链迁移至另一双链 6.DNA合成从另一3端引发 7.通过供体序列恢复缺口 1.更多的事实表明，重组是由双链断裂所启动. 现在认为，同源重组是减数分裂的原因，而不是减数分裂的结果。因此，双链断裂启动重组，也启动了减数分裂。 2.值得注意的是，在两交叉之间，由交换和分支移动产生的是异源双链，而由修复合成产生的是同源双链. 3.同源性并不意味序列相同。实验表明，两DNA分子必需具有75bp以上的同源区才能发生同源重组，同源区小于此数值将显著降低重组率。 4.同源重组是最基本的重组方式，它参与各种重要的生物学过程。复制、重组和重组修复三个过程是相关的，许多有关的酶和辅助因子也都是共用的。 几点说明: 三、同源重组有关的酶 大肠杆菌染色体上rec基因和ruv基因编码的一些酶。几个重要的重组酶是由recA、recB、recC和recD基因编码的；还有一个是由ruvC基因编码的。recB、recC和recD基因编码是RecBCD酶。它能够解开DNA螺旋，并偶尔地切开它的一条链引起重组。 RecA蛋白参与重组是最关键的步骤。 （一）RecA蛋白 有两个主要的功能： 诱发SOS反应和促进单链的同化(assimilation)。 单链同化(assimilation)即是指单链与同源双链分子发生链的交换，从而使重组过程中的DNA配对、Holliday中间体的形成，分支移动等步骤得以产生。 换句话说，RecA蛋白具有联会同源DNA分子的能力，并启动一个分子的单链侵入到另一分子的双螺旋上，通过取代双螺旋上的原始链而形成异源双链。 （二）RecBCD蛋白 单链DNA可以由许多途径产生，RecBCD酶是产生参与重组的DNA单链主要途径，它在重组中的作用是提供3’-末端的单链区域。 该酶的亚基分别由基因recB、recC和recD编码 RecBCD酶具有三种酶活性： ①依赖于ATP的核酸外切酶活性 ②可被ATP增强的核酸内切酶活 ③ATP依赖的解螺旋酶活性 chi位点这种顺序能增加它相邻顺序的重组频率，造成重组“热点”。 1.当DNA分子断裂时， RecBCD 酶即结合在线性DNA游离端，并使用ATP的能量沿着螺旋移动，先解开DNA，然后使DNA重新缠绕螺旋。 2.当特殊核酸内切酶碰到称为chi位点的特殊顺序(5’)GCTGGTGG(3’)时，泡中的单链部分在其3’侧4-6个核苷酸处被切开。 3.使DNA双链解旋并降解，产生