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重组DNA技术 第 一 节自然界的DNA的重组 DNA Recombination Holliday模型中,同源重组主要4个关键步骤 ①两个同源染色体DNA排列整齐 ②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接,形成Holliday中间体 ③通过分支移动产生异源双链DNA ④Holliday中间体切开并修复,形成两个双链重组体DNA,分别为: 第 二 节 基因工程 相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 重组DNA技术与医学的关系 (二)工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 (三)目的基因 cDNA 基因组DNA 能自主复制; 具有两个以上的遗传标记物,便于重组体的筛选和鉴定; 有克隆位点(外源DNA插入点),常具有多个单一酶切位点,称为多克隆位点; 分子量小,以容纳较大的外源DNA。 (一)目的基因的获取 1. 化学合成法 要求:已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) (见第22章) 三、重组技术与医学的关系 α 互补的检测 目 录 原位杂交 目 录 Southern印迹 目 录 鸡的β肌球蛋白的克隆和检出 目 录 重组DNA技术操作过程可形象归纳为 小 结 分 分离目的基因 切 限制酶切目的基因与载体 接 拼接重组体 转 转入受体菌 筛 筛选重组体 重组DNA技术操作的主要步骤 载体 质粒 噬菌体 病毒 目的基因(外源基因) 基因组DNA cDNA 人工合成 PCR产物 限制酶消化 开环载体DNA 目的基因 连接酶 重组体 转化 体外包装,转染 带重组体的宿主 筛选 表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交 目 录 表达体系的建立 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化 (六)克隆基因的表达 1. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用) 标准:选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 E.coli表达体系的不足 不宜表达真核基因组DNA 不能加工表达的真核蛋白质 表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白 大鼠胰岛素原cDNA 的表达和分泌 目 录 优点:可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA 可适当修饰表达的蛋白质 表达产物分区域积累 缺点:操作技术难、费时、不经济 转染 —— 将表达载体导入真核细胞的过程 方法:磷酸钙转染 DEAE葡聚糖介导转染 电穿孔 脂质体转染 显微注射 2. 真核表达体系 酵母、昆虫、乳类动物细胞 表达载体pFASTBACI 的物理图谱 目 录 目 录 (一)疾病基因的发现与克隆 根据基因定位克隆之并研究其性质,而认识疾病的分子机制。 (二)生物制药 重组DNA医药产品 预防霍乱 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 预防乙肝 乙肝疫苗(CHO, 酵母) 利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗 单克隆抗体 抗组织损伤 超氧化物歧化酶 激活、剌激各类白细胞 白细胞介素 抗病毒感染及某些肿瘤 干扰素(? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 治疗糖尿病 胰岛素 治疗侏儒症 生长素 刺激细胞生长与分化 生长因子(bFGF, EGF) 剌激白细胞生成 促红细胞生成素 剌激白细胞生成 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 促进凝血 血液因子VIII 抗凝 组织胞浆素原激活剂 功 能 产 品 目 录 基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理,在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。 (三)基因诊断 基本过程 区分或鉴定DNA的异常 分离、扩增待测的DNA片断 标准 . 能正确扩增靶基因; . 能准确区分单个碱基的差别; . 本底或噪声低,不干扰DNA的鉴定; . 便于完全自动化操作,适合大面积、大人群普查。 (四)基因治疗 定义 基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因,以纠正或补偿其基因的缺陷,从而达到治疗的目的。 方式 体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy) 性细胞基因治疗 (germ line gene therapy) 1. 产前诊断 2. 携带者测试 3. 症候前诊断 4. 遗传病易感性 (五)遗传疾病的预防 转基因
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