《有机酸工艺学》教学实习.docVIP

一、目的要求 利用黑曲霉柠檬酸流程，二、基本原理 。 三、实验材料 1菌种黑曲霉斜面菌种黑曲霉25~28℃斜面培养至孢子长好，作为活化后的种子。加入无菌水制备孢子悬液作为种子。 ?2、实验器材? 酒精灯；滤纸，漏斗；200m500mL烧杯；18X180试管；吸管10ml、5ml，150ml三角瓶；碱滴定管，铁台、蝴蝶夹：酚酞指示剂：200ml量筒；广范pH试纸；pH玻璃棒；布氏漏斗，抽滤纸，抽滤水泵，离心机和离心管，滴管，天平?标准NaOH0.1mol/L；H2SO4 0.1mol/L；甲液：称取15g硫酸铜（CuSO4·5H2O）及0.05g亚甲基蓝，溶于蒸馏水中并稀释到1000mL。乙液：称取50g酒石酸钾钠及75g NaOH，溶于蒸馏水中，再加入4g亚铁氰化钾K4Fe(CN)6]，完全溶解后，用蒸馏水稀释到1000mL，贮存于具橡皮塞玻璃瓶中0.1%葡萄糖标准溶液准确称取1.000g经98～100干燥至恒重的无水葡萄糖，加蒸馏水溶解后移入 1000mL容量瓶中，加入5mL浓HCl（防止微生物生长），用蒸馏水稀释到1000mL。?柠檬酸发酵培养硝酸铵2.0g，KH2P4 1.0g，MgS 0.25g，糖150g，水1000mlmol/L NaOH约2滴。取0ml上述培养液，加入00mL三角瓶中，包扎灭菌。四、实验步骤取柠檬酸发酵培养液3瓶，用向每瓶接入黑曲霉孢子黑曲霉孢子，2~28℃摇床培养d，摇床。1mL以0.1429mol/L 的NaOH 溶液滴定，记录消耗NaOH 的体积，每消耗1mL 0.1429mol/L NaOH 时溶液为1%酸度，也即为发酵液产酸率（%）。 4、还原糖含量测定 空白滴定：准确吸取费林试剂甲液和乙液各5.00mL，置于50mL锥形瓶中，加蒸馏水10mL。从滴定管滴加约9mL葡萄糖标准 g/L即1mg/ml）溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2s 1滴的速度继续滴加葡萄糖标准溶液，直至溶液蓝色刚好褪去为终点。记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。平行操作3次，取其平均值，按下式计算： （1-1） =1mg/ml x 11.55ml =11.55mg 式中：F10mL费林试剂（甲液和乙液各5.00mL）相当于葡萄糖的量，mg；C葡萄糖标准溶液的浓度，mg/mL；V标定时消耗葡萄糖标准溶液的总体积，mL。品溶液预测定：吸取费林试剂甲液及乙液各5.00mL，置于50mL锥形瓶中，加蒸馏水10mL，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以先快后慢的速度从滴定管中滴加样品溶液，滴定时要保持溶液呈沸腾状态。待溶液由蓝色变浅时，以每2s 1滴的速度滴定，直至溶液的蓝色刚好褪去为终点。记录样品溶液消耗的体积。样品溶液测定：吸取费林试剂甲液及乙液各5.00mL，置于锥形瓶中，加蒸馏水10mL，加玻璃珠3粒，从滴定管中加入比与测试样品溶液消耗的总体积少 1mL的样品溶液，加热使其在2min内沸腾，准确沸腾30s，趁热以每2s 1滴的速度继续滴加样液，直至蓝色刚好褪去为终点。记录消耗样品溶液的总体积。平行操作3次，取其平均值。 （1-2） 第2天： 表1：Mn+浓度对还原糖的影响 Mn+浓度 样品 空白 0.05mol 0.2mol 还原糖×10-3% 7.85 8.61 9.17 9.7 第4天： 表2：Mn+浓度对还原糖的影响 Mn+浓度 空白 0.05mol 0.2mol 还原糖×10-3% 8.8. 9.59 8.98 式中：v—发酵原液体积；F—10mL费林试剂（甲液和乙液各5.00mL）相当于葡萄糖的量，mg；V标定时平均消耗还原糖或总糖样品溶液的总体积，mL；V1还原糖或总糖样品溶液的总体积，mL；1000mg换算成g的系数。 Mn+浓度=0.05mol时： 糖酸转化率=18% Mn+浓度=0.1mol时： 糖酸转化率=20.4% 式中：C—柠檬酸最终浓度； A—发酵液起始糖浓度150g/l； B—发酵结束糖浓度。 6、柠檬酸纯化 采用钙盐法分离纯化柠檬酸。发酵结束后，将发酵液于4000rpm下离心10min，收集上清液用于总酸、pH值、还原糖含量测定及柠檬酸分离纯化，菌丝体用于生物量的测定。 向上清液中缓慢加入CaCO3粉末，观察是否有气泡产生，待溶液pH值升至6.0左右时停止添加CaCO3粉末，过滤，收集滤渣，向滤渣中加入一定量的5%硫酸溶液，过滤除去CaSO4沉淀，收集滤液，浓缩后结晶即得柠檬酸。 7、柠檬酸的定性分析 取少量结晶于25mL坩锅中，用直火炽灼，即缓慢分解，但不得发生焦糖臭。 取柠檬酸结晶用少量蒸馏水溶解，取2mL于25mL比色管中