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HPLC基础培训 主讲人 :李效宽 日期 :2008.7.25 主讲内容 一. HPLC基本原理 1. HPLC分离原理 样品组分在流动相和固定相之间进行分配，由于不同组分与固定相之间的交互作用能力(吸附.分配.离子交换.分子尺寸等)不同，使得不同组分在色谱柱上的移动速率不一样，从而产生色谱分离。(必要条件) 分配过程 样品组分的分离 2.HPLC的历史及演变 色谱起源 2.HPLC的历史及演变 本世纪初 茨维特的经典液体色谱 30~40年代 柱分配色谱，纸上色谱 50年代 气相色谱，薄层色谱 60年代 凝胶色谱，高效液相色谱 70年代 毛细管气相色谱，制备色谱 80年代 毛细管电泳色谱，色谱联用技术 90年代 光学异构体色谱，逆流色谱 色谱法的分类 3.色谱参数说明 (1) 保留时间 - t (2) 峰面积 - A (3) 分离度 - R (4) 容量因子 - k’ (5) 分配常数 - K (6) 选择性 - ? (7) 理论塔板数 - Neff (8) 理论塔板高度- HETP (1) Retention Time - t 分离度：两个相邻组分的保留值之差与其平均峰宽之比。 计算表明： 1：R0.8时，两组分不能完全分离 2：R=1时，两组分峰重叠约2% 3：R=1.5时，两组分峰完全分离。 (4) 容量因子 - k’ (5) 分配系数 - K K= k = 常数 （T恒定） Cm =组分在流动相中的浓度 Cs = 组分在固定相中的浓度 (6) 选择性 - ? ? = = (7) 理论塔板 数- Neff Neff = 5.54 (8) 理论塔板高度 - HETP HETP = L / Neff Van Deemter 方程 HETP = A+B/μ+Cμ A = 涡流扩散 B = 纵向扩散 C = 传质阻力 μ = 流动相线速度 (8) 理论塔板高度 - HETP 总结 1.分离 : 组分与固定相作用力之不同 2.柱效 : 峰形, Neff 3.分离程度 : R , ? 二. HPLC系统 1. 泵 2. 进样器 3. 柱 4. 检测器 1.泵 泵要求 大流量范围 灵活 高压 小粒径柱 无脉冲流动 延长柱寿命 惰性 生物样品分析 泵类型 结构 (1)注射泵 (2)往复泵 功能 (1)等度 (2)梯度 液相色谱的溶剂输送系统 (1)注射泵 (2)往复泵 2.进样系统 (1) 手动进样阀 (2) 自动进样器 固定体积进样的特点 需要大的进样针注射器取样品进样 一般的进样环（loop）大小是10-20微升，改变进样体积需要不同的进样环(loop)，改变loop比较麻烦 上样量必须大于loop体积的3倍以上，才能得到好的重现性，总样品量小时受到限制 通过旋转进样器的把柄，直接把样品进到色谱柱的柱头 （2）自动进样器 可变体积进样 操作方便、准确、重现性好，进样从1mL到100mL 不需要更换定量管loop 3.色谱柱 柱子的选择： 1.填料：硅胶、氧化铝、聚苯乙烯等 2. 键合相： C4、C8、C18、苯基、氨基等 3.孔径：60-100A 分子量2000 300A 分子量2000 4.粒径：2um-10um 5.内径：10mm以下（分析）， 10mm以上（制备） 6.长度：10、15、25、30mm 色谱柱各种变量 粒径的影响 填料参数 正相色谱 低极性流动相 中极性流动相 反向色谱法 固定相（非极性） -C18 , - C8 , -C4 , Phenyl 流动相(极性) Water,MeOH,MeCN,THF Type of Compounds:中性，弱酸，弱碱 Reverse Phase 高极性流动相 中极性流动相 流动相： 1. 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下： H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃 最常用的流动相组成是：“甲醇—H2O”和“乙腈—H2O”，由于乙腈的剧毒性，通常优先考虑“甲醇—H2O”流动相。 2. 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是： 正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇 最常用的是正已烷，虽然其价格较贵，但80％的顺、反和邻位、对位异构体仍然要用正相色谱来进行分离。 各种填料的使用比例 RP-HPLC 的优点