实验九、十自然界微生物样品采集及观察.pptVIP

实验九、十 自然界微生物样品采集及观察 宗 红 QQ：275527376 zonghong163@163.com 生工学院A401 1、了解微生物分离和纯化的原理； 2、掌握配制培养基的一般方法和步骤； 3、掌握微生物的无菌操作技术； 实验目的 实验原理 微生物分离与纯化 从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程成为微生物的分离与纯化； 一般多采用平板分离法，该方法操作简单，普遍用于微生物的分离与纯化； 实验原理 平板分离法原理： （1）在适合于待分离微生物的生长条件下培养微生物，或加入某种抑制剂形成只利于待分离微生物的生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物； （2）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得纯培养，获得单菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等方法完成； 实验原理 从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落的特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。有的微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。 实验试剂及器材 电子天平、药匙、烘箱、 量筒、玻璃棒、移液管、牛皮纸、纱布、线绳、培养箱、高压灭菌锅、超净工作台、移液枪 （ 1mL、 0.2 mL） 酵母提取物、胰蛋白胨、NaCl、琼脂粉、蒸馏水 实验样品： 土样：选择校园某一植被处土壤，去表层土，挖 5~20cm深度的土壤数10g，装入已灭菌的牛皮纸袋； 实验试剂及器材 分组：2人一组 每组需要准备： 100mL培养基（LB） 三角瓶2个 胰蛋白胨1%, 酵母提取物0.5%，NaCl 1%, 琼脂1.5% 45mL蒸馏水+玻璃珠 试管3支：每支4.5mL蒸馏水，加软塞 培养皿6个 涂布棒1个 1mL枪头、 0.2mL枪头 上述准备好后于高压灭菌锅内121℃灭菌15-20min。 实验方案 采 样 倒平板（无菌操作） 制备土壤稀释液（无菌操作） 平板分离单菌落（无菌操作） 培养 纯化、鉴定 配制培养基 具体实验步骤 1、准备工作 培养基及其他材料的准备、灭菌等； 超净工作台紫外杀菌15-20min； 2、倒平板（无菌操作） 每组6个平板 每个平板约15mL培养基 3、制备土壤悬浮液 5g土样 + 45ml无菌水， 振荡10-20min； 4、梯度稀释 取0.5ml土壤菌悬液移入含4.5ml无菌水的试管中，吹吸均匀，为稀释10倍的样品，依次进行梯度稀释10-2~10-4； 具体实验步骤 5、涂布 取0.2ml适当浓度的稀释液（ 10-2、 10-3 、10-4 ）涂布于相应平板，每个稀释度做2个平行，每种菌需要做6个平板，及时标记，涂布后静置10分钟。 注意： 涂布时先从低浓度开始； 标记：浓度、姓名、日期、注意位置 6、培养 将培养基倒置于培养箱中培养； 细 菌 霉 菌 放线菌 30℃培养箱 37℃培养箱 倒置培养24-48h 倒置培养3-5d 7、计数（平板菌落计数） 选取平板上长有50－200个菌落的稀释度计算每毫升的含菌量，同一稀释度的三个重复平板上菌落数应相差不大，且不同稀释度计算的数据也不应相差太大。 一般用菌落形成单位（CFU）来表示， 指在琼脂平板上经过一定温度和时间培养后形成的每一个菌落，是计算细菌或霉菌数目的单位。每个平板菌落数X稀释倍数得到每毫升中细菌数量，取平均值即可得到较准确的CFU/mL。 8、挑菌（纯化）（此步不做） 将培养后长出的单菌落数量、形态、培养特征进行观察，分别挑取单菌落于相应平板上划线、分离， 培养，检查菌落是否一致、单纯（也可以用显微镜涂片染色镜检是否是单一的微生物），如有杂菌需进一步纯化、分离。 9、菌落观察 菌落特征 霉菌 放线菌 10、显微镜观察 细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经染色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。 单染色法：利用单一染料对细菌进行染色的方法，操作简便，适用于菌体一般形态的观察； 在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料电离时染料电子带正电，易与带负电荷的细胞结合而使细菌着色。 常用