第5章 分子生物学的研究方法.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 基因枪法植物转基因的原理 Plant transformation via microprojectal bombardment 第四节 植物转基因技术 1、植物转基因技术的发展 2、植物表达载体的构建 3、植物转基因的过程 4、转基因植株的鉴定 pCAMBIA1301质粒 T-Border(right) Nos 3’ Gus 35S5’ Nco I 35S5’ Hyg(R) T-Border(left) 35S3’ Hin DIII Sal I Bam HI Eco RI Bst EII pCAMBIA1301 11837bp Lac Z pCAMBIA1301 pBS-RSP1/2 35S Hyg(R) T3 P Gus RSP2 LacZ NcoI pCAM-Gus Bam HI Hind III KpnI Bam HI KpnI Hyg(R) T7 P Gus RSP1 KpnI BamHI Gus Nos3’ pCAM-RSP1/2-Gus Hyg(R) 35S 35S 35S RSP2 RSP1 KpnI 用KpnI和BamHI 双酶切后连接 BamHI Nos3’ Nos3’ LB RB (1715 bp) First intron (1182 bp) LB LB RB RB 水稻蔗糖合酶基因启动子驱动Gus基因的表达载体构建 第四节 植物转基因技术 1、植物转基因技术的发展 2、植物表达载体的构建 3、植物转基因的过程 4、转基因植株的鉴定 2N6诱导愈伤 7-10d N6 -BA 预培养 2-3d 种子 优化的农杆菌介导法水稻高效快速遗传转化体系 AB-AS 诱导12h AB培养基活化12h YEP平板单菌落 液体MS浸泡15min 无生长素N6-AS共培养 3d N6-H选择培养20d 抗性愈伤组织的获得及植株再生 30d 62d~70d 1 2N6愈伤诱导 2 N6-BA预培养 3 N6-H选择培养 优化的农杆菌介导法水稻遗传转化过程 4 植株再生 第四节 植物转基因技术 1、植物转基因技术的发展 2、植物表达载体的构建 3、植物转基因的过程 4、转基因植株的鉴定 2.0kb 1.0kb 0.5kb 转基因植株中Gus基因的PCR检测 PCR analysis of Gus in putative transgenic plantlets M, DNA marker; P, 以PCAM-Gus1质粒为阳性对照; CK1,以水为模板的阴性对照; CK2,以未转基因植株为阴性对照; 1-6，转基因植株。 M, DNA marker; P, PCAM-Gus1 plasmid as positive control; CK1,the templete is water as negtive control; CK2, non-transformed plantlet as negative control; 1-6, putative transgenic plantlets. M P CK1 1 2 3 4 5 6 CK2 (563 bp) 转基因水稻根、茎和叶的GUS组织化学分析 A B C a b c a b c a b c A, 根系； B, 茎杆；C, 叶片。a, Gus 基因由35S启动子驱动； b, Gus 基因由蔗糖合酶基因RSuS1的启动子序列驱动； c, 未转基因水稻植株。 A, roots; B, stems; C, leaves. a and b represent the Gus gene is drived by 35S and RSuS1 promoter respectively; c, no-transformed plants as negative control. * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * （1）alpha-complementation(?-互补) The E. coli beta-galactosidase(?-半乳糖苷酶) can interact with substrate X-Gal and release blue substance. The LacZ gene encodes the alpha fragment(?片段) of the enzyme was flanked by the polylinker in some vectors an