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chapter 13 医药的基因工程 利用基因工程技术生产医药 基因治疗 鉴定控制遗传疾病的基因 已有100多种异源蛋白通过E.coli工程菌实现了产业化。如富含半胱氨酸残基的血清白蛋白（HAS）、尿激酶原（pro-UK）、金属硫蛋白（MT）；二硫键共价交联的二聚体蛋白巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）以及四聚体的血红蛋白（Hb）等。 1 重组医药 重组胰岛素 在E. coli中合成人生长激素 重组因子VIII 1.1重组胰岛素 胰岛素是由胰腺中的胰岛中的β细胞合成的，可以控制血液中的血糖水平。 最初是从牛或猪的胰脏中提取的。 纯化困难 1.1 重组的胰岛素 胰岛素为什么可用E. coli系统生产 胰岛素翻译后不需糖基化修饰。 分子量小。 胰岛素含有两个多肽，A链有21个氨基酸，B链有30个氨基酸。在人体中首先合成的是前胰岛素原，A链和B链通过C链相连，前端还有一段前导序列。翻译后，C链和前导序列被切除，A链和B链通过两个二硫键相连。 1.1 重组的胰岛素 策略一：人工合成A链和B链的基因，然后在E. coli中生产融合蛋白。 策略二：整个读码框构建表达载体。 Which one is better? 1.1 重组的胰岛素 1978年根据三联体密码子合成了A链和B链的基因。 然后构建了两个重组的质粒，一个编码A链，另一个编码B链，人工基因都被插入到lacZ’读码框内。 1.1 重组的胰岛素 方案二： 将整个地读码框B-C-A构建载体，这样就可以高效的形成二硫键。利用蛋白水解酶很容易将C链切下。 1.2 在E. coli中合成人生长激素 人的生长激素：生长激素和生长激素抑制素。 除侏儒症外，还可用于烧伤、骨折、出血性溃疡、组织坏死、肌肉萎缩、过度肥胖的辅助治疗。 1.2 在E. coli中合成人生长激素 促生长激素抑制素是第一个在E.coli中合成的人类蛋白。 1977年，K. Itakura实验小组完成的。 仅有14个氨基酸，非常适合于人工合成，与胰岛素的合成方法相似。 可以用于治疗肢端肥大症、急性胰腺炎和糖尿症。 1.2 在E. coli中合成人生长激素 生长激素的合成就存在一些问题: 蛋白有191个氨基酸，大约有600bp。 1.2 在E. coli中合成人生长激素 利用人工合成与cDNA克隆相结合的方法构建了载体。 mRNA是从垂体cDNA文库中获得的。 在生长激素的cDNA中有HaeIII的单一切点，可以将基因切成两部分，较长的片段，从第24个氨基酸到第191个氨基酸，被用来构建载体，人工合成较短的片段。 经过修饰的基因连接到含有lac启动子的表达载体中。 1.3 重组因子VIII 人类的VIII因子，在血液凝集中的一种中心因素。血友病的最普遍的形式是不能合成VIII因子，破坏了血液的正常的凝固。 1.3 重组因子VIII 治疗血友病的唯一途径是注射纯化的VIII因子蛋白。 VIII因子的纯化困难、昂贵，治疗一位患者每年大约需要10000$。 血液中的病毒颗粒很难去除。 1.3 重组因子VIII 使用全长的cDNA，利用仓鼠（东欧或亚洲产）作为寄主，但蛋白质的产量非常低。 不能有效将初产物转化为有活性的形式。 1.3 重组因子VIII 使用分离的两个cDNA片段，分别编码大亚基、小亚基，分别连接表达载体。 以Ag启动子引导（是鸡的β-actin 肌动蛋白和兔β-globin球蛋白的杂交序列），下游连接来自SV40病毒的多腺苷酸化信号。 引入仓鼠的细胞系，产量提高了10倍多，而且仍然具有活性。 1.4 合成其它的重组人类蛋白 2 重组疫苗（vaccines) 疫苗是一种无活性的抗原，注入血液后刺激免疫系统合成抗体。 存在的问题： 100%失活：口蹄疫疫苗曾导致牛发病。 组织培养困难，产量很低：肝炎B病毒组培不生长 。 2 重组疫苗（vaccines) 活疫苗 死疫苗 亚基疫苗（subunit vaccines）：只含有病原体的一种或几种抗原，而不含有病原体的其他遗传信息。 2 重组疫苗 以重组蛋白的方式生产疫苗 病毒的组分也有免疫能力 活的重组疫苗 2 重组疫苗 以重组蛋白的方式生产疫苗 乙肝病毒(Hepatitis B virus, HBV)疫苗：利用基于2um质粒载体，在S. cerevisae中合成。 产量很高，注射入猴子对HBV免疫，同样在人类中也有较好的效果。 目前科学家正利用仓鼠生产更好的疫苗。 2 重组疫苗 1796年，Jenner发现牛痘病毒可以刺激人类的免疫系统产生抗体抵抗更危险的天花病毒。 疫苗vaccine这一词来自于vaccinia牛痘，1980s在全世界范围内根除了天花。 2 重组疫苗 重组活痘苗疫苗 双链DNA，分子量187kb，在