2009研究生分子生物学－基因组核酸的复制.pptVIP

滚环模式复制 先切断双链环状DNA中的一条链，5’端与特殊蛋白相连，3’由DNA聚合酶催化延伸； 以未切断的一条环状链为模板，合成DNA。结果导致3’端不断延长，5’不断被甩出成为游离单链； 当游离单链到一定程度时，开始合成互补链。 三、不同基因组RNA可通过不同的模式进行复制 1 基因组双链RNA复制的过程是双链复制 双链RNA病毒进入宿主细胞后，以两条RNA链为模板，复制出基因组双链RNA。 e.g. 呼肠孤病毒 双链RNA病毒； 进入宿主细胞后，成为亚病毒颗粒，含有RNA聚合酶； 以负链RNA链为模板合成正链RNA（即可为mRNA，又可成为复制中间体）； 翻译的蛋白和新合成的正链RNA包装成前病毒核心； 在前病毒核心中以正链RNA再合成负链RNA，重新形成双链RNA。 2 基因组单链正链RNA以负链为模板进行复制 病毒进入细胞后，首先以基因组RNA为模板合成出负链，再以负链为模板合成基因组RNA。 3 基因组单链负链RNA以正链RNA为模板复制 病毒进入细胞后，首先以基因组RNA为模板合成出正链，再以正链为模板合成基因组RNA。 4 逆转录病毒的基因组RNA需要通过DNA中间体进行复制 逆转录病毒的基因组为单链正链RNA，病毒进入宿主细胞后，由逆转录酶以RNA为模板合成出双链cDNA； cDNA插入细胞基因组成为前病毒，然后以前病毒为模板，转录出正链RNA，即为病毒基因组。 四、细胞的每一次分裂过程都伴随基因组的复制 1 细菌染色体DNA在每次细胞分裂过程中复制一次 复制起始频率是可以调节的：快速分裂的细菌复制起始频率高，在一轮复制结束前可以启动新一轮复制；而分裂缓慢的细菌复制起始频率则较低。 特定的机制保证复制频率与细胞分裂周期相适应。 2 真核细胞基因组DNA在每个细胞周期中复制一次 在S期，DNA复制从多个起始点启动，双向复制；有的起始点开始早，有的开始晚，但在整个S期，所有的起始点只开放一次，保证每个周期中所有的染色体DNA都得到复制，而且只复制一次。 受3个层次的控制：细胞周期水平、染色体水平和复制水平。关键的是与细胞周期相同步的控制。 3 质粒DNA和病毒基因组核酸的复制通常不受细胞分裂过程的影响 质粒是能够独立复制的细菌基因组成分：质粒本身的复制调控系统控制着质粒的拷贝数。 病毒基因组核酸也是自主复制：病毒进入宿主细胞后，可利用宿主的核酸合成系统复制自身的基因组核酸，不受宿主细胞分裂周期的影响。 * 1958年Meselson和Stahl的实验首次有力地支持了半保留复制方式。他们先将大肠杆菌放在15NH4C1培养基中生长15代，使几乎所有的DNA都被15N标记后，再将细菌移到只含有14NH4C1的培养基中培养。随后，在不同的时间取出样品，用十二烷硫酸钠(SDS)裂解细胞后，将裂解液放在CsC1溶液中进行密度梯度离心(140000g，20小时)。离心结束后，从管底到管口，溶液密度分布从高到低形成密度梯度。DNA分子就停留在与其相当的CsC1密度处，在紫外光下可以看到形成的区带。14N-DNA分子密度较轻(1.7g/cm3)，停留在离管口这较近的位置;15N-DNA密度较大停留在较低的位置上。当含有15N-DNA的细胞在14NH4C1培养液中培养一代后，只有一条区带介于14N-DNA与15N-DNA之间，这时在15N-DNA区已没有吸收带，说明这时的DNA一条链来自15N-DNA，另一条链为新合成的含有14N的新链。培养两代后则在14N-DNA区又出现一条带。在14NH4C1中培养的时间愈久，14N-DNA区带愈强，而14N-15NDNA区带逐渐减弱，但始终未出现其他新的区带。按照半保留复制方式培养两代，只能出现14N-15NDNA两种分子，而且随着代数的增加14N-DNA逐渐增加。Meselson和Stahl的实验完全证实了保留复制的设想。? 半不连续复制-相关实验 ? 脉冲标记实验脉冲标记实验（pulse-labelingexperiment）。以E.coli为材料，在培养时，培养基中加入同位素[3H]标记的dTTP，经30秒后，DNA刚开始复制，分离DNA，然后在碱中沉淀，变性，让新合成的单链和模板链分开，再用CsCl密度梯度离心，以沉降的快慢来确定片段的大小，再检测放射标记，结果表明被3H标记的片段，也就是新合成的片段，沉淀系数为20S左右，即都是长1000~2000Nt的DNA片段，而亲本链要比它大20~50倍；第二组实验是脉冲追逐实验。目的是检测早期合成的DNA片段以后的命运又是如何的？是依然如旧的短片段，还是连接成了长片段。这个实验是先进行标记培养30秒，以后除去同位素继续培养几分钟，再分离DNA在碱中沉淀，检测结果。先合成的（带标记）的DNA不再是短片段，而和总DNA的情况相似，沉淀系数