基因工程基因表达.pptVIP

chapter 10 研究基因的表达 学习内容： 转录的分析方法，基因内是否含有内元，以及起始位点和终止位点的位置。 基因表达调控 鉴定克隆基因的表达产物。 1 克隆基因的转录 方法： 电子显微镜观察 利用单链特异的核酸酶。 1.1 电子显微镜观察 如果基因内含有内元，DNA序列部分区域就不能与其mRNA配对杂交。 要利用化学试剂处理，然后电镜观察。 一般情况下，DNA分子要与蛋白质混合，例如细胞色素C，包被的分子利用乙酸铀酰, 乙酸双氧铀或者其他的增加电子密度的试剂。 1.2 利用核酸酶分析DNA-RNA杂交分子 原理：单链特异核酸酶，如S1核酸酶，可降解单链DNA或者RNA，对双链的DNA或者DNA-RNA杂交分子不起作用。 1.2 利用核酸酶分析DNA-RNA杂交分子 方法： 含有基因的DNA分子与RNA转录物进行杂交，未杂交的DNA将被降解，产生完全的双链杂交分子。 通过碱处理可以将单链的DNA从杂交分子中分离出来。 然后通过电泳确定分子的大小。 该种方法稍加改进，即可以鉴定转录的起始位点 1.3 研究RNA转录的其他技术 引物延伸反应 RNA印迹法（Northern blotting） 逆转录PCR(RT－PCR） cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends，RACE） RNA测序：效率很低，通常采用测定RT-PCR产物的方法了解RNA序列。 2 研究基因表达的调控 鉴定DNA分子上蛋白的结合位点 通过deletion分析鉴定控制序列 2.1鉴定DNA分子上蛋白的结合位点 结合蛋白质后分子将增加重量 结合蛋白质后，将保护DNA分子免受核酸酶的降解。 修饰干扰实验（Modification interference assay） 2.1鉴定DNA分子上蛋白的结合位点 结合蛋白质后分子将增加重量 凝胶滞后 gel retardation。 首先酶切结合区域。 调控区域可能小于10bp，很难精细的定位。 2.1鉴定DNA分子上蛋白的结合位点 Footprinting with DNase I （ DNase I足迹法） 原理：结合蛋白后，可以保护该段分子免受核酸酶的降解。 Footprinting with DNase I 对DNA片段的一端放射性标记，然后再与调节蛋白混合。 加入DNase I，保证DNA分子的部分降解。如果DNA片段未与蛋白结合，将产生一系列的标记的片段。然而结合蛋白区域将不被酶切，这样产生的系列片段是不完全的，受到保护的片段在电泳中是不存在的。在放射性自显影中呈现足迹。 修饰干扰实验（modification interference assay） 硫酸二甲酯等甲基化试剂修饰核苷酸，甲基化的DNA不能再与蛋白结合 哌啶试剂断裂甲基化的位点 见课本199页 2.2 通过deletion分析鉴定控制序列 原理：删除控制序列，可以改变克隆基因的表达调控方式。 报告基因 缺失分析 2.2 通过deletion分析鉴定控制序列 报告基因将模仿原有基因的表达模式。 报告基因的选择原则： 首先它控制的是寄主生物体所没有的性状； 报告基因必须容易检测； 可定量分析。 表10-1 高等生物中应用的部分报告基因 2.2 通过deletion分析鉴定控制序列 利用不同的策略可以删除基因上游的任何区域。 如果表达量增加，说明删除了抑制区域 表达减少说明删除了增强子 组织特异性的变化表明组织反应序列被删除。 3.1 HRT和HART鉴定基因的翻译产物 释放转移杂交法（HRT, Hybrid-release translation）和阻断转移杂交法（HART, Hybrid-arrest translation）可以鉴定克隆基因的翻译产物。两种方法都利用纯化的mRNA通过细胞外翻译系统直接合成蛋白质。 3.1 HRT和HART鉴定基因的翻译产物 体外无细胞翻译系统： 麦胚提取物 兔网织细胞提取物 体外无细胞翻译系统 含蛋白质合成所必需的核糖体，tRNA和其他蛋白质合成所必需的分子，具有很强的合成蛋白的能力。然后加入mRNA和必需的20种氨基酸，其中Met是35S标记的。mRNA被转录成放射性蛋白质的混合物，可以通过电泳分离，自显影显示出来。每一条带都代表mRNA所翻译的一种蛋白。 3.1 HRT和HART鉴定基因的翻译产物 在HRT中，首先将cDNA变性，结合到纤维素膜上或者尼龙膜上，加入mRNA样品，能与cDNA杂交的特异mRNA保留在膜上，除去未结合的分子后，可以收集mRNA并加入细胞外系统中，这样将产生cDNA编码的特异蛋白质。 3.1 HRT和HART鉴定基因的翻译产物 HART并不除去未杂交的分子，而是将整个膜转入细胞