王镜岩生物化学课件-第三章蛋白质的通性，纯化和表征(修改）.pptVIP

1.3. 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。 当溶液pH=等电点时，蛋白质粒子净电荷为零，在电场中不移动； 当溶液pH＞等电点时，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动； 当溶液pH＜等电点时，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。 II.不可逆沉淀（变性沉淀） 强烈沉淀条件 破坏蛋白质胶体溶液稳定性 也破坏蛋白质结构和性质 沉淀不能再重新溶解 如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐 和生物碱沉淀等 2.5.蛋白质沉淀方法 2.5.1盐析 溶液加入高浓度中性盐后，盐离子与生物分子表面的带相反电荷的离子基团结合，中和了生物分子表面的电荷，降低了生物分子与水分子之间的相互作用，生物分子表面水化膜逐渐被破坏，当盐浓度达到一定的限度时，生物分子之间的排斥力降到很小，此时生物分子很容易相互聚集，在溶液中的溶解度降得很低，从而形成沉淀从溶液中析出。 产生盐析的另一个原因是大量盐离子自身的水合作用降低了自由水的浓度，使生物分子脱去了水化膜，暴露出疏水区域，由于疏水区域的相互作用，使其沉淀析出。 盐溶—盐析 等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶 原因？ 盐析 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出 原因？ 3.1.分离纯化的意义 ①从生物材料中分离制备蛋白质、核酸，研究其结构与功能，对于了解生命活动的规律，阐明生命现象的本质有重大意义； ②工业生产的需要：食品、发酵、纺织、制革等工业，需要大量的高活性的酶制剂； 　（如用淀粉酶制造葡萄糖、麦芽糖、糊精以及糖浆等） ③医疗的需要：如用猪胰岛素治疗糖尿病； ④基因工程的需要。 3.2.分离纯化的要求 1、纯度：主要取决于研究的目的和应用上的要求。如作为研究其一级结构和空间结构的蛋白、一级结构与功能的关系的蛋白质制剂、工具酶和标准蛋白、酶法分析的酶制剂，都要求均一；工业、医药方面应用的酶和蛋白质制剂，达到一定纯度即可，不要求均一。 2、活性：要求大分子保持天然构象状态，有高度的生物活性。 3、收率：希望收率越高越好，但在分离纯化过程中总有不少损失，而且提纯步骤越多，损失越大。 3.3.分离纯化的一般程序 生物大分子的分离纯化一般可分为以下几个阶段： ①材料的选择和预处理； ②破碎细胞及提取（有时还需要进行细胞器的分离）； ③分离纯化：包括粗分级分离和细分级分离。 3.4.分离纯化的前处理 3.4.1.材料的选择与预处理 选择材料主要根据实验目的而定。工业生产上注意选择含量高、来源丰富、易获得、制备工艺简单、成本低的动植物组织或微生物做原料。科研选材则无需考虑上述问题，只要能达到实验目的即可。 实验材料选定后，常常需要进行预处理，如动物材料需要除去一些与实验无关的结缔组织、脂肪组织；植物种子需要除壳；微生物需要将菌体与发酵液分开。另外，必须尽可能保持材料的新鲜，尽快加工处理，若不立即进行实验或加工，应冷冻保存。 3.4.2.细胞的破碎 分离提取某一生物大分子，首先要求生物大分子从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不丢失其生物活性。因此应选择适当的方法将组织和细胞破碎。但若材料是体液（如血）或生物体分泌到体外的分泌物，则不必进行组织细胞的破碎。 组织细胞的破碎方法很多，根据不同的实验规模，不同的实验材料和实验要求，使用的破碎方法和条件也不同。 一般动物组织和细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎； 植物组织和细胞由于具有纤维素、半纤维素和果胶等物质组成的细胞壁，一般常用与石英砂和适当的提取液一起研磨的方法破碎或用纤维素酶处理也能达到目的； 细菌细胞的破碎比较困难，因为整个细菌细胞壁的骨架实际上是一借共价键连接而成的肽聚糖囊状大分子，非常坚韧。破碎的方法常有超声波震荡、与石英砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理（以分解肽聚糖）。 3.4.3 细胞器的分离 细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞还有叶绿体。 如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。 细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。各种细胞组分按质量大小的不同，经过不同速度的离心后，沉降于离心管的不同部位，经多次分步离心后，即可获得所需组分。 3.5.提取 组织细胞破碎过程中，大量的胞内酶及细胞内含物被释放出来，必须立即将其置于一定条件下和溶剂中，让制备物充分溶解，并尽可能保持原来的天然状态，避免因长久放置造成制备物的分解破坏，这就是提取。 　?提取实际上就是将制备物从复杂的生物体系中转移到特定的人工液相体系中（通常是水、缓冲液、稀盐