基因工程在石斛兰上的应用.pptVIP

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送你一束转基因花 简单的认识盛开的各种石斛兰 山谷里盛开的野生石斛兰 盛开的石斛兰 盛开的石斛兰 盛开的石斛兰 盛开的石斛兰 盛开的白石斛兰 盛开的石斛兰 盛开的石斛兰 盛开的白石斛兰 白石斛兰 报春石斛兰 野生石斛兰 转基因石斛兰 实验目的 实验原理 实验材料 技术路线 具体的实验步骤 实验目的 通过基因工程改变石斛兰的花色 花色是观赏植物的一个重要特征,也是生产中花卉品质的重要指标。花色是光线照射到花瓣上穿透色素时部分被吸收,部分被海绵组织反射折回,再度通过色素层而进入我们眼帘所产生的色彩,但花色素起主要作用。 实验目的 花色素受下列因素影响: 色素细胞的PH值、金属离子、辅助色素、花瓣表皮形态等。 * 本实验主要针对改变液泡的PH值而改变花色。 实验原理 1.Pr基因可以改变液泡的PH,进而改变花色 2.以石斛兰种子诱导的原球茎为受体材料,以含有GUS基因和Pr基因的植物表达载体Ti质粒为外源DNA,利用农杆菌介导的方法将Pr基因转入石斛兰 3.经GUS染色初步确定目的基因已导入受体细胞,后续进行PCR鉴定及Southern杂交 4.结合植物组培培育出转基因植株 Pr基因简介 Pr基因的cDNA序列长2.3kb,包含一个完整的与拟南芥及水稻液泡Na﹢/H﹢交换器(exchangger)高度同源的开放阅读框,因而Pr基因被认为也编码一个Na﹢/H﹢交换器。 Tanaka等(2000年)首先在裂叶牵牛(Ipomoea nil)中获得了与调节液泡PH有关的Pr(purple)基因,该基因编码的蛋白对液泡上Na﹢/H﹢的交换具有调节作用,进而调节液泡PH。 Pr基因简介 植物分子遗传学研究表明,液泡内的PH值是影响花卉颜色的重要因素之一,PH较低时花趋向于红色,较高时趋向于白色,接近7时呈现蓝色。 实验材料 石斛兰种子诱导的原球茎 根癌农杆菌(含有外源基因) 各种溶液与缓冲液 使用仪器 技术路线 PR基因 导入 根癌农杆菌Ti质粒 根癌农杆菌的培养 侵染 石斛兰原球茎 共培养 选择培养 继代选择培养 生根培养 GUS检测 PCR鉴定及Southern杂交 扩大培养 移栽植株 生产应用 实验步骤 1、在裂叶牵牛(Ipomoea nil)中获得Pr(purple)基因。 实验步骤 2、PR基因导入根癌农杆菌Ti质粒 a.用限制性核酸内切酶切割PR基因与Ti农杆菌质粒 b.然后用DNA连接酶连接PR基因与Ti农杆菌质粒 c.把含PR基因的Ti质粒转入农杆菌中 实验步骤 3、根癌农杆菌的培养 a. 从平板上挑取单菌落,接种到附加相应抗生素的细菌培养液体培养基中,恒温摇床上于一定的温度和转速培养。 b. 取培养好的菌液,按照一定比例转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中,可在与上相同的条件下培养。 实验步骤 4、侵染石斛兰原球茎 1、根癌农杆菌对植物细胞识别和附着 2、根癌农杆菌农杆菌对植物信号物质的感受 3、根癌农杆菌Ti质粒上vir基因以及染色体上 操纵子的活化; 4、T-DNA复合体产生 5、T-DNA复合体转运 6、T-DNA整合到植物细胞中 重组质粒 实验步骤 5、共培养 将浸染过的外植体接种在愈伤组织诱导的 培养基上,在24度暗培养条件下共培养3天。 实验步骤 6、选择培养 将经共培养的外植体至脱菌培养基上,于16h、12000lx光照和8h黑暗25度培养。 实验步骤 7、继代选择培养 选择培养2-3周后,外植体的转化细胞将分化出抗性的不定芽或产生抗性愈伤组织,将这些抗性材料转入筛选培养基上,进行继代扩繁培养,或者转入附加选择压的生长或分化培养集中使其生长或诱导分化。 实验步骤 8、生根培养 待不定芽长至1cm以上时,切下并初入含有选择压的生根培养基上进行生根培养。 实验步骤 9、GUS检测 简介:gus基因是目前常用的一种报告基因,是β-D- 葡萄糖苷酸酶(gus)基因,其表达产物β-葡萄糖苷酸酶 (GUS)能催化裂解一系列的β-葡萄糖苷酸 ,它可以将5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸酯(X-Gluc)分解为蓝色的物质,也可以将4-甲基-伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酯(4-MUG)分解为蓝色物质。 其检测方法简单、快速、灵敏、稳定,且背景活性低。 gus基因

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