蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法.pptVIP

蛋白质含量测定法—考马斯亮蓝法（Bradford法） 蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩尿法、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。考马斯亮蓝法(Bradford法)是近些年才普遍使用起来的测定法。其中考马斯亮蓝法和Folin-酚试剂法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比双缩尿法法灵敏100倍以上。 [目的]：共同学习考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 [实验原理] 考马斯亮兰G-250 染料,在酸性溶液中与蛋白质结合,使染料的最大吸收峰的位置,由465nm变为595nm,溶液的颜色也由棕黑色变为稳定的蓝色,颜色深浅同蛋白质含量成正比,通过测定其光密度值,可求出蛋白质含量. 有研究认为,染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。 器材:1.722型可见光分光光度计2.漩涡混合器3.试管16支 使用试剂：1.标准蛋白质溶液：1.00mg/ml牛血清白蛋白（BSA）。2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。 [实验方法步骤]：1.制作标准曲线2. SDS(十二烷基硫酸钠)干扰试验（不讲）3.未知样的测定另外感兴趣的同学可尝试做精密度、稳定性、重复性、加样回收率等实验。 1.制标准曲线方法(1).取10支试管，分别编号后按 表1剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。 (2).加完染料20min后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A595。(3).用标准蛋白浓度（mg/ml）为横坐标，用A595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。根据测得未知样品的A595 ，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。 根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算:样品蛋白质含量(μg/g鲜重) =  2. SDS干扰实验(1).取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。(2).加完染料20min后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A595 。 [实验数据处理与结果分析] 1.标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格 根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。 根据线性拟合公式Y=aX+b计算所测溶液的蛋白质的含量。若某号管测出结果误差太大，则舍弃不用，用剩余管的测量值计算未知溶液的蛋白质含量 （单位为： mg/ml)。 2.SDS干扰数据和图表2 考马斯亮蓝SDS干扰实验表格 理论上，十二烷基硫酸钠(SDS)对考马斯亮蓝法测蛋白质含量有干扰，随着SDS浓度的增加，其混合液的595nm处的吸收峰逐渐降低，而后有一小段回升，最后趋于渐近线。 根据表2，以A595为纵坐标，SDS浓度为横坐标，作图2。  通过本实验成果有： 1.考马斯亮蓝标准法测得未知溶液中蛋白质含量为x mg/ml。2.探究了SDS的干扰分析情况。 [干扰实验结果分析]：当溶液中存在一定量的SDS后所测得的吸光度比正常值相对减小。但是随着SDS浓度的增加，吸光度的减小量应没有呈现出很明显的规律。 从SDS与蛋白质的作用机理来看，SDS可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构。SDS和蛋白质结合后使蛋白质-SDS复合物上带有大量的负电荷，平均每两个氨基酸结合一个SDS分子，这时各种蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖。由于SDS 的存在，阻碍了染料与碱性氨基酸和芳香族氨基酸的结合，使得吸光度减小。 由于SDS与染料分子对蛋白质的竞争结合，使得显色减弱，吸光度值降低，因此在曲线前段呈下降趋势；但由于SDS破坏氢键，使得蛋白质的空间结构更加伸展，一些原来包裹在结构中的碱性氨基酸和芳香族氨基酸暴露出来，所以会有少量的吸光度回升；但最终SDS与蛋白质的结合达到所处溶液条件下的“饱和”时，过量的SDS就不起作用了，曲线是最后为平缓段。 要去除SDS的干扰，可以利用它与K+结合生成沉淀的性质将其去除。K+对考马斯亮蓝方法不产生干扰。 考马斯亮蓝法的优点：（1）灵敏度高，其最低蛋白质检测量可达1μg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质-染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化很大。（2）测定快速、简便、只需要加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5min左右，颜色在5min至20min之间