第二章4 基因工程及其在食品科学中的应用.pptVIP

1、基本原理 PCR技术是在模板DNA、引物（人工合成）、Mg2+和4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）存在的条件下，利用DNA聚合酶（Taq酶）催化作用，经过DNA变性、引物与模板结合（复性）和延伸的循环过程，体外大量扩增特异DNA片段。 （1）引物设计与合成 设计合成一对与目的DNA片段两侧翼序列分别互补的寡核苷酸引物。其中一引物与目的区段上游一条模板链的序列相互补，而另一引物与目的区段下游另一条模板链的序列相互补。 （4）引物延伸 将反应体系温度升到72℃左右，在Mg2+存在的条件下，Taq聚合酶催化dNTP按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端（5’→3’方向延伸），使引物延伸，形成两条与模板互补的新链。 以上为一次PCR循环（变性、复性和延伸），新合成的链可作为下一轮循环的模板 PCR原理Flash 演示 （2）反应条件 3、引物的复性（退火）温度 复性温度的选择可以根据引物的长度及其G+C的含量确定。 当长度在15~25bp时，引物的复性（退火）温度可以通过Tm=4(G+C)+2(A+T)计算得到。 在Tm允许范围内，Tm越高，PCR特异性越强。 4、PCR引物设计的一般原则 （1）序列应位于高度保守区,与非扩增区无同源序列。 （2）引物长度适宜，一般为15-30 bp； （3）引物中G+C占40-60%； （4）碱基尽可能随机分布,尤其3’端不能以3个连续G或者3个连续C结束。否则，会使引物在模板G十C富集区引发错误； （5）引物内部避免形成二级结构（不存在互补序列）； （6）两引物间避免产生引物二聚体（互补碱基不超过4个） ； （7）引物3’端为关键碱基；5’端无严格限制； （8）引物3’端就不要终止于密码子的第三位，因为密码子的第三位易出现简并现象 引物设计流程 Cytb基因全场扩增引物（通用） L14724 5’ – GACTTGAAAAACCACCGTTG –3’ H15915 5’ – CTCCGATCTCCGGATTACAAGAC –3’ 5、引物的5’ 端修饰 PCR的延伸从两个引物的3’端开始，决定PCR产物的特异性。而5’端则限定着PCR产物的长度。对引物5’端进行修饰非但不影响正常的PCR，反而有助于对PCR产物的分析及进一步的操作。 6、未知序列的扩增 （1）锚定PCR（anchored PCR, A-PCR） 锚定PCR用于扩增已知一端序列的目的DNA。在未知序列一端加上一段多聚dG（Poly G）的尾巴，然后分别用多聚dC(Poly C)和已知的序列作为引物进行PCR扩增。锚定PCR帮助克服序列未知或序列未全知带来的障碍。在未知序列未端添加同聚物尾序，将互补的引物连接于一段带限制性内切酶位点的锚上，在锚引物和基因另一侧特异性引物的作用下，将未知序列扩增出来 （2）简并引物PCR (degenerate primer PCR，DP-PCR) 所谓简并引物是指碱基序列不同，但有相同碱基数的一组针对某一基因相同区段的寡核苷酸混合物。 值得指出的是，由于次黄嘌呤可与任何碱基配对，因此在碱基高度简并位置可使用次黄嘌呤替代。 简并引物PCR主要用于仅知蛋白质部分序列而求知其编码基因序列的研究、寻找已知基因家族中新成员的研究等 （4）单一特异引物PCR(single specific primer PCR，SSP-PCR) 用合适的限制性内切核酸酶酶切基因组DNA，将酶切片段与合适载体连接重组。利用特异引物(与特异酶切片段一端互补)和通用引物(与载体特异互补)来扩增特异酶切片段。 （5）臆断引物PCR(arbitrary primer PCR，AP-PCR) 在温度等不严格的反应条件下，将臆断选择的一个非特异引物与待分析的模板DNA通过错配而复性。如果该非特异引物能作为两个反向引物与模板DNA双链相距一定距离复性，那么经过PCR，两两反向引物所限定的DNA片段就会得到高效扩增。通过对扩增产物的凝胶电泳分离，最后可以获得反映待分析基因组特征的指纹图。 7、其他常用的PCR技术 （1）逆转录PCR(reverse transcribed PCR，RT-PCR) 以总RNA或mRNA为模板进行逆转录，然后再进行PCR扩增。该法主要用于基因表达等研究。 （3）多重PCR (multiplex PCR) 在同一试管中加入多对引物，扩增同一模板DNA的几个区段。 该法主要用于检测大基因上可能发生的多处缺失等突变。 （4）巢式P