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关于Cdh1 小干扰RNA 载体的构建及鉴定 【摘要】目的：构建Cdh1 小干扰RNA 载体，并将其转染至Hela 细胞进行鉴定. 方法：根据pENTRTM/H1/TO 中间载体要求，设计Cdh1 小干扰RNA 载体的干扰序 列及无干扰作用的对照序列，合成相应的DNA 单链，退火后连接到 pENTRTM/H1/TO 线性载体，形成完整载体，进行测序鉴定. 分别将测序鉴定成 功的Cdh1 小干扰RNA 载体及对照载体采用脂质体法转染Hela 细胞，转染后48 h 提取细胞总RNA 及细胞总蛋白，采用实时定量PCR 和Western Blot 检测Cdh1 的表达. 结果：经测序鉴定成功构建Cdh1 小干扰RNA 载体和对照载体，分别命 名为pENTR/shCdh1 和pENTR/shcontrol. 与未转染及转染pENTR/shcontrol 的 Hela 细胞相比，转染pENTR/shCdh1 的Hela 细胞Cdh1 表达降低（P0.05）. 结论：成功构建Cdh1 小干扰RNA 载体，并能下调Hela 细胞Cdh1 的表达. 【关键词】细胞周期 细胞分裂 RNA 小干扰 Hela 细胞 0 引言 Cdh1 是细胞周期后期分裂促进复合物（anaphase promoting complex， APC）的一个调节亚基，在细胞周期调控中发挥着重要作用. 近年来研究发现， Cdh1 APC 在哺乳动物神经元中有大量表达，具有调节轴突生长和突触形成的 功能，其在中枢神经系统疾病的发生发展中起重要作用［1］. 为了进一步探讨 Cdh1 的功能，我们拟构建Cdh1 小干扰RNA 载体，并将其转染至Hela 细胞进行 鉴定. 1 材料和方法 1.1 材料 pENTRTM/H1/TO 载体试剂盒、TOP10 感受态细菌和脂质体 Lipofectamine2000 均购自Invitrogen 公司（美国）； DMEM/F12 培养基、小 牛血清购自Gibco 公司（美国）；实时定量PCR 试剂盒购自Takara 公司（日 本）；LightCycler 实时荧光定量PCR 仪为Roche 公司（美国）. 1.2 方法 1.2.1 载体的构建 根据pENTRTM/H1/TO 载体要求和 参考文献 ［2］设计Cdh1 小干扰RNA 载体的干扰序列及无干扰作用的对照序列，合成相 应的DNA 单链，具体设计如下: 干扰序列top strand 5′ CACCAATGAGAAGTCTCCCAGTCAGCGAACTGACTGGGA GACTTCTCA 3′， bottom strand 5′AAAATGAGAAGT CTCCCAGTCAGTTCGCTGACTGGGAGACTTCTCATT 3′; 对照序列top strand 5′ CACCAAGAATGTCATCTACCACGGGCGAACCCGTGGTAGATGACATTC 3′， bottom strand 5′AAAAGAATGTCATCTACCACGGGTTCGCCCGTGGTAGATGACATTCTT 3′. 将干扰序列和对照序列根据退火条件95℃退火4 min，室温自然冷却5～10 min 得到退火产物， 用 T4 DNA 连接酶连接到 pENTRTM/H1/TO 线性载体上，16℃ 连接2 h，连接产物转化TOP10 感受态细菌，平铺入含卡那霉素（50 mg/L）抗 性平板中过夜培养，挑取单菌落扩增培养. 提取质粒后，由英骏生物技术有限 公司进行DNA 测序鉴定. 质粒分别命名为pENTR/shcdh1 和pENTR/shcontrol. 1.2.2 细胞转染采用脂质体转染法 将pENTR/shcdh1 和pENTR/shcontrol 质粒分别转染Hela 细胞，转染前1 d 将Hela 细胞传代至六孔板，密度为90％左右，在2 个Eppendorf 管中均加入 250 μ L OPTI MEM Ⅰ培养基，然后分别加入10 μ L 脂质体和4 μ g 质粒混匀， 室温下孵育5 min. 轻柔混合两管液体，37℃孵育20 min，加入Hela 细胞中， 将细胞置于37℃， 50 mL/L CO2 培养箱中转染4 h 后换成含有100 mL/L 小牛 血清的DMEM/F12 培养基. 转染后48 h，提取细胞总mRNA，逆转录成cDNA. 1.2.3 实时定量PCR 检测Cdh1 的表达 以逆转录产物为模板进行实时定量 PC