关于h460细胞与单个核细胞三维立体混合培养中mmp2和mmp9的表达.pdf

关于H460 细胞与单个核细胞三维立体混合培养中MMP 2 和MMP 9 的表达 【摘要】目的：研究单个核细胞和肺癌细胞三维立体混合培养对MMP 表达的影 响. 方法：活性胶原立体培养分为H460 细胞组（HG）、单个核细胞组（MG）、 混合组（HMG）3 组，观察癌细胞的生长状况，用明胶酶谱法测定不同时间点各 组MMP 2 和MMP 9 表达. 结果：各组细胞在立体胶原内生长良好；MG 未明 显分泌MMP 2 和MMP 9，HG 和HMG 分泌MMP 2 和MMP 9，且HGM 分泌 的明显多于HG. 结论：单个核细胞和癌细胞混合培养后MMP 分泌增多. 【关键词】三维立体培养 基质金属蛋白酶 H460 细胞 单个核细胞 肺肿瘤； 转移 0 引言 基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase， MMP）是高度保守的依赖 于Ca2+和Zn2+的内切蛋白水解酶，可降解细胞外基质（extracellular matrix， ECM）中的多种成分，是肿瘤侵袭和转移过程中起关键作用的酶之一［1］. 在 正常稳定状态组织中，多数MMP 表达量极少，而在肿瘤组织中表达量上升. 其 中MMP 2 和MMP 9 均被认为是肿瘤侵袭转移的标志之一. 大量基质细胞和 炎症细胞在癌组织中可以看到，但它们对肿瘤生物学特性的影响以及在肿瘤病 理过程中的作用尚不清楚. 我们应用三维立体培养和明胶酶谱电泳技术，研究 非小细胞肺癌细胞和单个核细胞混合培养时对MMP 2 和MMP 9 表达的影响. 1 材料和方法 1.1 材料 非小细胞肺癌H460 细胞株由中国人民解放军总医院惠赠；CO2 培养箱（德国 Heraeus 公司）；倒置显微镜（日本Olympus 公司）；培养瓶和 24 孔培养板（美国Corning Costar 公司）；电泳系统（美国Bio rad 公 司）；DMEM 培养液和胰酶（美国Gibco 公司）；新生牛血清（杭州四季青）； 单个核细胞分离液（天津TBD 公司）；蛋白质Marker （美国MBI 公司）. 1.2 方法 截取大鼠全尾，分离出胶原丝，经平衡液和乙醇反复漂洗后，用 0.4 mmol/L 乙酸在4℃过夜，离心后制成20 g/L 胶原溶液. H460 细胞用DMEM （加100 kU/L 青、链霉素）和100 mL/L 新生牛血清传代培养，用第18～20 代 细胞做立体培养. 胰酶消化，离心，收集细胞，取少量DMEM 混匀细胞，细胞计 数. 另采集健康志愿者外周新鲜血20 mL，用单个核细胞分离液按照使用说明 分离单个核细胞，主要是淋巴细胞和单核细胞，将收集的细胞用DMEM 混匀，细 胞计数. 1.2.1 细胞立体培养 按比例混合胶原、4×DMEM 和灭菌水，使其成为等离 子、等渗、1×DMEM 的液体胶原，其中胶原浓度为0.75 g/L. 分H460 细胞组、 单个核细胞组、H460 细胞和单个核细胞混合组3 组接种细胞于胶原内，细胞浓 度为4×108/L，以0.5 mL/孔移入24 孔培养板内，待胶原固化后每孔加入 DMEM 培养液1 mL，在37℃， 50 mL/L CO2 条件下培养5 d. 1.2.2 MMP 2 和MMP 9 测定 按比例加入300 g/L 丙烯酰胺溶液，1.5 mol/L Tris （pH 8.8），蒸馏水，明胶，100 g/L SDS，100 g/L 过硫酸铵， TEMED 制备100 g/L 分离胶，灌注于玻璃板，待明胶聚合后灌注依比例配置的 50 g/L 浓缩胶，并插入Teflon 梳子. 将灌制好的明胶安置于垂直电泳槽，样 品用2×Tris 甘氨酸电泳缓冲液等比例混匀，点样. 以恒电流方式电泳约4 h，取出明胶，按每块胶100 mL 体积的25 mL/L 的Triton X 中浸泡2 h. 蒸 馏水每100 mL 加入Tris 0.56 g，用6 mol/L HCl 溶液调整pH 7.50，加入 CaCl2 和ZnCl2 制成缓冲液，将浸泡好的明胶用蒸馏水洗涤后浸入缓冲液， 37℃，震荡过夜. 明胶简单洗涤后用 0.4 g/L 考马斯亮蓝 R250 染色约 30 min， 最后用70 mL/L 乙酸，50 mL/L 甲醇溶液充分洗涤至条带清晰. 2 结果 分子质量92 和84 ku 的条带是MMP 9，分子质量是72 和62 ku 的条带 是MMP 2 （图1）. 结果显示主要表达的是MMP