外源基因在原核中的表达2008.pptVIP

外源基因在原核细胞中的表达 基因表达： 系指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。生物体的遗传信息都是以核苷酸序列编码的形式储存在遗传物质DNA上, 基因表达是目的基因DNA在导入的细胞内转录成mRNA, 再以mRNA指导翻译成蛋白质。基因的表达依赖于有效的转录和 mRNA的正确翻译以及翻译后的加工处理等各个环节的调节作用。 基因表达系统： 由基因表达载体（把外源基因导入宿主细胞的载体）和宿主细胞通过两者之间的相互作用而组成的一个实现外源基因表达的有机整体。 分为原核表达系统（代表是大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、棒状杆菌表达系统）和真核表达系统（代表是酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统）。 外源基因表达的目的 用于蛋白的功能、结构及作用机制研究 获得大量活性蛋白，用于生产和治疗 表达外源蛋白应具有的因素 宿主：真核细胞；原核细胞 载体：真核载体；原核载体 外源基因：含有内含子与否 大肠杆菌E. coli 表达系统优缺点 优点： （1）遗传学和生理学背景清楚，容易操作； （2）表达量高。 缺点： （1）没有mRNA的剪切机制，因此必须预先除去基因中的内含子； （2）没有蛋白质翻译后加工的机制，因此有些蛋白是不适宜用大肠杆菌进行表达； （3）外源蛋白由于表达量大，速度快，蛋白来不及折叠，容易发生聚集，形成包涵体，需要进行重新溶解和复性。 大肠杆菌是外源基因表达的首选系统，一般只有在表达产物不能正确折叠或由于缺少翻译后修饰而没有生物活性时，才考虑使用其他的表达体系。 外源基因在原核表达系统中表达的基本条件 载体：通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白； 外源基因不能带有间隔顺序（内含子），需删除内含子和5’非编码区； 利用原核细胞强启动子和SD顺序等调控元件控制外源基因的表达,插入的外源基因必须放在原核的启动子控制之下，也就是使原核的RNA聚合酶能够识别插入的基因。 ； 外源基因与表达载体连接后维持正确开放阅读框架（ORF）,其遗传密码不得缺失、遗漏、或错位及错码； 利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达 ，mRNA稳定且可有效转译，转录后的mRNA在菌体必须相当稳定，并且能有效地进行翻译，转译的蛋白分子在菌体内不致于受菌体蛋白酶的降解。 载体要求 载体由复制区、启动子和抗性基因等多种元件组成，按功能分成克隆载体和表达载体，按进入受体细胞类型分原核载体、真核载体 、穿梭载体。其必备的基本条件是： 1、具备自主复制能力，至少有一个复制起点，以保证重组DNA可以在宿主细胞内得到扩增； 2、?具备较多的拷贝数，易与宿主细胞的染色体DNA分开，便于提纯； 3、具备较小的相对分子量，易于操作，并有足够的接纳目的基因的容量； 4、在非必需的DNA区段有较多的单一限制酶酶切位点，便于目的基因的克隆； 5、有一个或多个筛选标记（如对抗生素的抗性、营养缺陷型或显色表型反应等），以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞； 6、具有较高的遗传稳定性。 载体能够独立复制； 具有方便、灵活的克隆位点和筛选标记； 具有能为大肠杆菌RNA聚合酶所识别的强启动子 启动子及其两侧的调控序列，应可接受诱导调控； 大肠杆菌表达载体中通常使用调控型的强启动子： Lac启动子：乳糖操纵子受分解代谢系统的正调控和阻遏物的负调控，无乳糖时，调节基因（I）产生阻遏蛋白与操纵基因结合，阻止RNA聚合酶结合进而阻止转录；有乳糖时，乳糖能与阻遏蛋白结合，使其变构解离而行使转录功能。而LacZ基因可由IPTG（异丙基硫代- β-D-半乳糖）诱导转录。 trp启动子：色氨酸启动子（ Trp）的阻遏蛋白在有色氨酸时，二者结合，阻遏蛋白变构激活而与启动子结合，阻止RNA聚合酶的转录。无色氨酸时，阻遏解除，因β-吲哚丙烯酸是色氨酸的竞争性抑制剂，常用作诱导剂，诱发色氨酸启动子转录。 tac启动子：trp-lac杂合启动子,只需用IPTG诱导转录即可。 PL PR启动子：受λ噬菌体cI基因产物的负调控，温度诱导，在较低温度（28～32℃）培养时，cI基因产物产生抑制作用；在温度升至42 ℃时其被破坏，于是PL和PR启动子开始转录。 T7噬菌体启动子：其可表达T7噬菌体RNA聚合酶的受体菌DE3，可用IPTG诱导调控。 其它启动子：如营养、糖原、pH、溶氧、生物素等对菌体发酵和代谢过程条件控制以实现对目标蛋白表达调控型启动子。 具有翻译起始信号，包括起始密码子和SD序列，而SD序列与起始密码子ATG之间要有合适的距离; SD序列与核糖体亚基的16S rRNA 3′末端序列互补