成为粘性末端.PPT

　妙用RNaseH 　　　这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。 　　　小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。 　　DNA PolI除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。 ③ cDNA第二链合成（置换合成法） mRNA cDNA第一链 3’ 5’ 引物 mRNA cDNA第一链 3’ 5’ mRNA mRNA DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 cDNA第二链 cDNA第一链 3’ 5’ RNaseH DNA ligase 去引物 置换合成法 在双链cDNA末端接上人工接头（含限制性内切酶黏性末端），即可与载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。 接上人工接头 粘性末端 CCC CCC 末端转移酶 （4）cDNA与载体连接 （5）重组载体转化受体菌 分子探针杂交法：用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southern blot杂交。 文库 载体 探针 电泳后杂交放射自显影 测序分析 文库的筛选（screening） Genomic library与cDNA library区别 ① 基因组文库克隆的是任何片段，包括未知功能的DNA序列、调控基因，cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因。 ② 基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，受发育的调控因子的影响。 ③ 基因组文库中编码基因是真实的基因，含有内含子和外显子；cDNA克隆的是不含内含子的基因。 相对于cDNA文库，基因组文库的优点： cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列； cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难； 从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA 中的非转录区段序列，不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能。 cDNA文库的优点 cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。 cDNA文库的筛选比较简单易行。 每一个cDNA文库都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。 cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。 cDNA克隆还可用于真核细胞mRNA的结构和功能 * 利用一系列序列特异性的巢式引物和一个短的任意引物引导扩增已知序列的侧翼序列的反应。 * * * * * * 　　基因组文库：将某一生物基因组DNA片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因。 　　操作：将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 第二节 基因组文库的构建与基因分离 基因组文库（genomic library） 　 　　基因组DNA文库 　　　　从特定组织提取的染色体基因组DNA 　　cDNA文库 　　　　mRNA反转录成的cDNA拷贝 　　 基因文库由外源DNA片段、载体和宿主组成。 按外源DNA片段的来源分基因文库分为 载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。 载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。 ?载体系列： 容量为 23 kb cosmid载体： 容量为 45 kb YAC： 容量为 1 Mb BAC: 容量为 300 kb 构建基因文库的载体选用 （1）对载体的要求 （2）目前常用的载体 1、文库的完整性： 　 文库应包含基因组的完整序列信息 2、基因组信息的可重建性： 　 重建基因组的完整信息 3、文库的大小： 　 即文库中应包含的独立重组子数目 基因组文库应满足的条件 　　理论值: 　　　基因组文库的克隆数目＝基因组DNA总长/DNA插入片段的平均长度。 　例如： 　　细菌基因组DNA总长度=4.6 × 106kb 　　酶切后的DNA片段平均长度= 15kb 　　基因