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没食子酸与Tau蛋白R3多肽相互作用的研究 　　摘要：以阿尔茨海默病相关Tau多肽片段R3作为研究对象，采用ThS荧光法监测R3的自聚集过程，探讨了没食子酸与R3多肽之间的相互作用。实验结果表明没食子酸能够有效抑制R3的自聚集。 　　关键词：阿尔茨海默病　Tau蛋白　没食子酸　ThS荧光 　　中图分类号：Q51　文献标识码：A　文章编号：1007-3973(2011)009-071-02 　　 　　阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease，AD)是最常见的一种老年型痴呆症。据不完全统计，发达国家有50％-70％的早老性痴呆症是AD。阿尔茨海默病有两大病理性特征：神经元内由Tau蛋白异常聚集形成的神经纤维性缠结(Neurofibril―lary Tangles，NFTs)，神经元外由Aβ沉积形成的老年斑(Se-nile Plaques，SPs)。美国《神经学》杂志报道NFTs与老年痴呆症的临床病情具有高度的正相关性。 　　NFTs是双螺旋纤丝(Paired helical filament，PHF)的聚合体，PHF的主要成分则是高度磷酸化的微管相关蛋白(Microtubule Associated Protein，MAP)Tau。正常的Tau蛋白通过微管结合区域(Microtubule Binding Domain，MBD)和微管结合，一方面可以促进微管的形成，另一方面可以增加微管的稳定性。在外界因素的影响下Tau蛋白会从微管脱离，同时发生自聚集成双股螺旋丝，进而聚合形成PHFs，此时的Tau蛋白将完全失去其生物学功能。 　　Tau蛋白有两大结构域：外伸结构域和微管结合域，其中微管结合域决定了Tau蛋白的生物功能，因此通常采用这一片段的多肽进行研究。全长Tau蛋白的微管结合域包含4个重复性单元(Repeat)：R1，R2，R3和R4，每个单元由31或32个氨基酸残基构成。体外实验中发现R2和R3可以表现出和全长Tau蛋白相似的性质，比如它们都可以在诱导剂存在的情况下产生自聚集形成PHFs和NFTs，这也使得R2和R3成为模拟Tau聚集的最佳多肽片段，而R3拥有最小的自聚集浓度和最快的自聚集速度，所以本文采用R3片段来模拟全长Tau蛋白的聚集行为。 　　3，4，5一三羟基苯甲酸，俗称没食子酸(Gallic acid，GA)，是一种有机酸，常见于五倍子、茶等植物中。因为同时含有酚羟基和羧基，很有可能和Tau蛋白发生氢键作用等分子间作用力，因此本实验研究了没食子酸对R3的抑制作用，希望对阿尔茨海默病的治疗提供一定的实验基础。 　　在体外实验中，通常采用肝素(Heparin)等多聚阴离子来诱发Tau蛋白的聚集来模拟其自聚集过程。本文也用Heparin引发R3聚集并以ThS作为荧光探针来研究GA对其聚集作用的影响。 　　 　　1　实验部分 　　 　　1.1　仪器与试剂 　　仪器：F7000荧光分光光度计，恒温水浴箱，恒温培养箱，高温高压灭菌器。 　　试剂：没食子酸(AR)，R3(95％)，Tris-HCI缓冲液，ThS荧光探针，Heparin(引发剂)。所有溶液均由高温高压消毒处理后的三重蒸馏水配制而成。 　　1.2　方法与步骤 　　(1)所有实验试剂的溶液配制：Tris-HCI缓冲液(50raM，pH=7.5)，R3(1 mg／mL，300pM)，ThS(200pM)，Heparin(76μM)，没食子酸(3mM)。 　　(2)ThS荧光动力学扫描：向0,5mL离心管中，分别加入：R3多肽(25pL，最终浓度15pM)、ThS(25μL，最终浓度10μM)、没食子酸(x μL)，Heparin(25pL，最终浓度3.8μM)，并用Tris-HCI缓冲液定容至500μL。震荡混匀后，在37℃,嚏温水域环境下进行荧光的Time Scan。参数设置：激发波长为440nm，发射波长为510nm，入射狭缝和发射狭缝宽度皆为10nm，最大扫描时间为7200s。实验结果如图1所示。 　　(3)ThS荧光法监测GA浓度对R3自聚集的影响：按上述方法配制一系列含不同浓度GA的样品，置于37℃恒温培养箱培养4小时，然后测其在510nm处的发射峰强度。实验参数如下：激发波长为440nm，发射波长范围465-700nm。实验结果如图2所示。 　　 　　2　实验结果 　　 　　2.1　ThS荧光动力学分析 　　在ThS存在的情况下，聚集之后的R3会在510nm处出现发射峰，并且峰强度和R3的聚集程度呈现正相关性。本实验考察了两种不同浓度的GA对R3聚集过程的影响(图1)，发现高浓度的没食子酸能够有效抑制R3的聚集过程。 　　2.2　ThS荧光法检测GA浓度对R3自聚集的影响 　　实验中R3的浓度为