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没食子酸与Tau蛋白R3多肽相互作用研究

没食子酸与Tau蛋白R3多肽相互作用的研究   摘要:以阿尔茨海默病相关Tau多肽片段R3作为研究对象,采用ThS荧光法监测R3的自聚集过程,探讨了没食子酸与R3多肽之间的相互作用。实验结果表明没食子酸能够有效抑制R3的自聚集。   关键词:阿尔茨海默病 Tau蛋白 没食子酸 ThS荧光   中图分类号:Q51 文献标识码:A 文章编号:1007-3973(2011)009-071-02      阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是最常见的一种老年型痴呆症。据不完全统计,发达国家有50%-70%的早老性痴呆症是AD。阿尔茨海默病有两大病理性特征:神经元内由Tau蛋白异常聚集形成的神经纤维性缠结(Neurofibril―lary Tangles,NFTs),神经元外由Aβ沉积形成的老年斑(Se-nile Plaques,SPs)。美国《神经学》杂志报道NFTs与老年痴呆症的临床病情具有高度的正相关性。   NFTs是双螺旋纤丝(Paired helical filament,PHF)的聚合体,PHF的主要成分则是高度磷酸化的微管相关蛋白(Microtubule Associated Protein,MAP)Tau。正常的Tau蛋白通过微管结合区域(Microtubule Binding Domain,MBD)和微管结合,一方面可以促进微管的形成,另一方面可以增加微管的稳定性。在外界因素的影响下Tau蛋白会从微管脱离,同时发生自聚集成双股螺旋丝,进而聚合形成PHFs,此时的Tau蛋白将完全失去其生物学功能。   Tau蛋白有两大结构域:外伸结构域和微管结合域,其中微管结合域决定了Tau蛋白的生物功能,因此通常采用这一片段的多肽进行研究。全长Tau蛋白的微管结合域包含4个重复性单元(Repeat):R1,R2,R3和R4,每个单元由31或32个氨基酸残基构成。体外实验中发现R2和R3可以表现出和全长Tau蛋白相似的性质,比如它们都可以在诱导剂存在的情况下产生自聚集形成PHFs和NFTs,这也使得R2和R3成为模拟Tau聚集的最佳多肽片段,而R3拥有最小的自聚集浓度和最快的自聚集速度,所以本文采用R3片段来模拟全长Tau蛋白的聚集行为。   3,4,5一三羟基苯甲酸,俗称没食子酸(Gallic acid,GA),是一种有机酸,常见于五倍子、茶等植物中。因为同时含有酚羟基和羧基,很有可能和Tau蛋白发生氢键作用等分子间作用力,因此本实验研究了没食子酸对R3的抑制作用,希望对阿尔茨海默病的治疗提供一定的实验基础。   在体外实验中,通常采用肝素(Heparin)等多聚阴离子来诱发Tau蛋白的聚集来模拟其自聚集过程。本文也用Heparin引发R3聚集并以ThS作为荧光探针来研究GA对其聚集作用的影响。      1 实验部分      1.1 仪器与试剂   仪器:F7000荧光分光光度计,恒温水浴箱,恒温培养箱,高温高压灭菌器。   试剂:没食子酸(AR),R3(95%),Tris-HCI缓冲液,ThS荧光探针,Heparin(引发剂)。所有溶液均由高温高压消毒处理后的三重蒸馏水配制而成。   1.2 方法与步骤   (1)所有实验试剂的溶液配制:Tris-HCI缓冲液(50raM,pH=7.5),R3(1 mg/mL,300pM),ThS(200pM),Heparin(76μM),没食子酸(3mM)。   (2)ThS荧光动力学扫描:向0,5mL离心管中,分别加入:R3多肽(25pL,最终浓度15pM)、ThS(25μL,最终浓度10μM)、没食子酸(x μL),Heparin(25pL,最终浓度3.8μM),并用Tris-HCI缓冲液定容至500μL。震荡混匀后,在37℃,嚏温水域环境下进行荧光的Time Scan。参数设置:激发波长为440nm,发射波长为510nm,入射狭缝和发射狭缝宽度皆为10nm,最大扫描时间为7200s。实验结果如图1所示。   (3)ThS荧光法监测GA浓度对R3自聚集的影响:按上述方法配制一系列含不同浓度GA的样品,置于37℃恒温培养箱培养4小时,然后测其在510nm处的发射峰强度。实验参数如下:激发波长为440nm,发射波长范围465-700nm。实验结果如图2所示。      2 实验结果      2.1 ThS荧光动力学分析   在ThS存在的情况下,聚集之后的R3会在510nm处出现发射峰,并且峰强度和R3的聚集程度呈现正相关性。本实验考察了两种不同浓度的GA对R3聚集过程的影响(图1),发现高浓度的没食子酸能够有效抑制R3的聚集过程。   2.2 ThS荧光法检测GA浓度对R3自聚集的影响   实验中R3的浓度为

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