抗凝血DNA提取方案.docVIP

血液样本处理流程 样品运输：血液样品必须在抽血当天送至实验室，送血员必须从侧门进入。 收集的样本在送达后必须立即进行编号登记，并认真填写样品登记表: 研究编号：肝癌及对照以HC-****表示，胃癌及对照以gC-****表示，肠癌及对照以CC-****表示。 柠檬酸钠抗凝血标记为P，非抗凝血标记为S。 例：肝癌抗凝血样本，表示为HP-0001；肝癌非抗凝血样本, 表示为HS-0001； 肠癌抗凝血样本，表示为CP-0003; 肠癌非抗凝血样本，表示为CS-0003。 唐都医院介入科血样：蓝色管为抗凝血，红色管为非抗凝血；A表示病例，B表示对照； 唐都医院普外血样： 00代表对照，01代表病例。 血清和血浆分离：编号登记后立即进行 （1）1200g离心8min，在超净台中小心将血清（或血浆）吸到1.5ml的ependorf管中，注意不要吸到白细胞层，距离白细胞层余0.2ml上清时停止吸取。 （2）再次8000g离心5min，在超净台中分装到0.5ml Ependorf管中，每管0.3-0.4ml，做好标记，管盖上标注抗凝血编号或非抗凝血编号，同时管壁上标注相同编号，立即－70℃冻存。 血细胞可在4℃放置不超过2天并用于提取DNA。 抗凝血DNA提取方案 实验原理： 人全血基因组DNA主要存在于有核白细胞中，故在提取时先去除不含DNA的红细胞，然后破碎白细胞胞膜及核膜，释放出DNA。利用硅基质吸附材料吸附DNA时，高浓度盐离子破坏硅基质水分子结构，形成阳离子桥，与DNA结合，当盐被清除后，再水化的硅石破坏了基质和DNA之间的吸引力，因此DNA从硅基质上洗脱下来。 试剂盒 OMEGA的血液基因组提取试剂盒 操作步骤 实验前准备： 1．在使用新的kit时，根据kit的说明在DNA Wash Buffer中加入指定量的无水乙醇。 2．RNase A在-20℃保存，使用时取出，用后立即放回。 3. 将10倍的ERL浓缩液用蒸馏水稀释至1倍浓度，置于4℃冰箱中预冷。 4. 溶解OB蛋白酶:300mg OB蛋白酶溶于15ml Elution buffer，。 5. 洗脱DNA前，将TE置于70℃水浴锅中预热。 血样预处理： 3-5ml体积的抗凝血加入ERL Buffer至13ml。涡旋20秒充分混匀。 4℃孵育15分钟，期间短暂涡旋两次。溶液变得半透明时，表明红细胞已经裂解完全。 700g 离心5分钟沉淀白细胞，小心吸弃上清。 加入6ml的ERL于管内，充分重悬细胞。 700g 离心5分钟。弃去上清,管中剩余约0.5mlERL时涡旋使细胞完全重悬。 裂解细胞： 加入2ml TL buffer，涡旋20秒充分混匀。 加入150ul OB preotease（20mg/ml） 55℃于水浴涡孵育，每隔20-30 分钟涡旋一次。充分裂解细胞60min. 加入2.1ml Buffer BL，涡旋。 加入20ul Rnase A，短暂涡旋。65℃孵育10分钟。冷却至室温。 DNA吸附： 加入2.2ml 无水乙醇，涡旋20秒充分混匀。 将3.5ml 样品溶液，包括沉淀物，转移至装有吸附柱的收集管中。6000g 离心5分钟。弃去流出液。 将离心柱重新套回15ml收集管，转移剩余的样品溶液于柱内。6000xg 离心5 分钟。弃去流出液。 洗涤纯化： 吸取3ml Buffer HB 洗涤。4000xg 离心5分钟。弃去流出液。 吸取3mlDNA Wash Buffer 于柱内。4000xg 离心5分钟。弃去流出液。 重复步骤14一次。将收集管4000xg 离心15分钟。注意：这一步对沥干影响下游应用的乙醇至关重要。将离心柱套入干净的15ml 离心管。 DNA洗脱收集： 加入500μl预热的（70℃）Elution Buffer于柱内，室温放置5分钟，4000xg 离心5 分钟。再加入500μl预热的Elution Buffer重复洗脱一次。如果发现裂解完红细胞，管中白细胞较少，用500μl预热的（70℃）Elution Buffer洗脱一次后再将其加入管中重复洗脱一次。 结果测定及DNA分装： 将洗脱出的DNA吸出20μl，加入80μl的纯化水稀释，紫外（UVmini-1240）定量，选用固定的DNA程序测定。 吸取x（x＝7500/含量）μl DNA到0.5ml的ependorf管中，补加300－x μL TE，使其浓度达到25μg/ml。 将所有DNA置于 -70℃保存。 20.立即将DNA浓度记录在样品登记表中。 注意事项： 裂解红细胞，离心后弃去上清时，注意一次倒完，不要反复多次，避免倒掉白细胞。 前几步涡旋时，应充分涡旋。在裂解细胞后的涡旋，不能过长时间涡旋，避免DNA断裂。 RNase A 和OB preotease应分装保存。在使用时，