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DADS 诱导人胃癌 MGC803 细胞相关基因差异表达分析硕 士 研 究 生：解娜指导教师：苏琦 教 授摘要目的：研究二烯丙基二硫（Diallyl disulfide, DADS）诱导人胃癌细胞差异表达基 因，绘制其差异基因表达图谱，寻找 DADS 作用人胃癌细胞的侯选相关基因， 为揭示 DADS 抗胃癌机制，开拓人胃癌防治的新途经奠定基础。 方法：体外培养人胃癌MGC803细胞，倒置显微镜和光镜观察DADS处理MGC803 细胞形态的改变；MTT比色法检测不同浓度DADS对MGC803细胞增殖活性的影 响；碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase, ALP）活性检测法观察DADS对MGC803 生化代谢的作用；抑制性消减杂交（Suppression subtractive hybridization，SSH）、 T/A 克隆、测序以及生物信息学方法分析DADS诱导MGC803细胞过程中基因的 差异表达。结果：细胞形态学观察：30mg/L DADS处理MGC803细胞24h后，与对照组相比， 胞浆丰富，细胞核变小，染色变淡，核仁数目明显减少，散在分布生长，部分细 胞变圆，浮起。MTT显示：10、20、30、40、50mg/L DADS对胃癌MGC803细胞增殖的抑 制率分别为15.2%、26.2％、51.4％、57.3%、70.0%，呈浓度依赖关系。ALP活性检测：ALP比活性呈浓度依赖性下降，10、20、30、40、50mg/L 处理MGC803细胞后，其下降率分别为13.7%、25.6%、49.9%、66.5%、72.0%。 总RNA提取和mRNA纯化：提取的总RNA可见明显的28S、18S和5S的清晰无拖尾条带，mRNA为清晰―smear‖带，无DNA和RNA污染。SSH 结果：连接效率检测，Rsa I 酶消化产物 cDNA 与接头连接效率大于 25%；消减有效性实验，未消减样品在 15 次循环时即可见 G3PDH 阳性条带，消 减产物在循环数达 25－30 次才见扩增产物，且产物量明显减少；巢式 PCR 产物 分析显示，消减组产物片段明显少于未消减组产物片段，前者可见清浙的条带，后者呈瀑布状；差异消减 cDNA 文库的建立及鉴定，T/A 克隆后，转化大肠杆菌JM109 菌后，随机挑取 80 个白色克隆，提取质粒 DNA，EcoRⅠ酶切、PCR 分 析发现 60 个克隆具有大小约 100～1000 bp 的插入片段。测序及生物信息学分析：测序共获得 34 个序列完整的克隆。GenBank 同源 性比较，筛选出 DADS 诱导胃癌细胞前后差异表达的 12 个基因，序列同源性为 98%-100 %。正向消减文库中，上调表达基因有细胞周期相关基因 p21WAF1、 ENO1，抗氧化相关基因 FTH1、PRDXⅡ，细胞骨架相关基因 PFN1，细胞代谢 相关基因 MDH2；反向消减文库中，下调表达基因为细胞周期相关基因 PTOV1， 细胞骨架及细胞迁移相关基因 ANXA2、RAC1、WDR1，细胞代谢相关基因 ALDOA 以及癌基因 EWSR1。结论：1. 成功构建DADS诱导MGC803细胞差异表达基因的正、反向消减 cDNA文库。2. 初步筛选了12个DADS诱导MGC803细胞差异表达基因，上调的有p21WAF1、ENO1、 PFN1、 PRDXⅡ、FTH1、MDH，下调的是PTOV1、ANXA2、RAC1、WDR1、ALDOA、EWSR1，分别与细胞周期、细胞骨架、细胞迁移、细胞代 谢、抗氧化等相关。关键词：胃癌；MGC803细胞；二烯丙基二硫；抑制消减杂交；差异表达基因Differentially Expressed Genes Related to Human Gastric Cancer MGC803 Cells Induced by Diallyl DisulfideAbstractObjective: To isolate and cloning differentially expressed genes in human gastric cancer MGC803 cells induced by diallyl disulfide (DADS), explore the related molecular mechanisms.Methods: Cell morphology was observed by inversion microscope and optics microscope MGC803 cells. Inhibition of MGC803 cell proliferation was shown by MTT assay. The activities of alk