daintain在巨噬细胞raw2647中的功能研究word格式论文.docx

摘要Daintain (大炎肽)是 20 世纪 90 年代发现的新巨噬细胞因子，是 IFN-γ 诱导而产 生，分子量 17 kDa，定位于胞浆，具有钙离子结合能力的炎症支架蛋白。Daintain基因定位于人 6 号染色体组织相容复合体Ⅲ（MHCⅢ）区，MHCⅢ含有多种与免疫 应答相关的基因，暗示 Daintain 在免疫应答中发挥重要作用。目前关于 Daintain 在 体内的生理功能还未研究清楚，但是研究发现其参与多种炎症疾病的发生和发展， 包括器官移植排斥，中枢神经系统损伤和多种自身免疫性疾病等，可以肯定 Daintain 在单核巨噬细胞发挥免疫应答过程中起重要的作用。17-β-雌二醇（E2）是一个重要的免疫调节剂，调节多种细胞因子的表达。但 E2 对 Daintain 表达的调节作用未有报道。本文首先以巨噬细胞系 RAW264.7 为模型， 探讨 E2 对 Daintain 的调节作用及可能的分子机制，已取得主要研究成果如下：1) 通过 RT-PCR 和 Western Blot 方法检测 E2 对 Daintain 的调节作用，在生理浓 度范围（10-10 M -10-7 M）的 E2 能显著上调 Daintain mRNA 和蛋白水平的表达，且在 10-10 M -10-8 M 内是剂量依赖性的调节方式。虽然 E2 在 10-7 M 浓度时诱导 Daintain 的 表达量比 10-8 M 低，但是仍高于对照组。2) RAW264.7 细胞组成性地表达有功能性的雌激素受体 α（ERα），不表达雌激 素受体 β（ERβ）。雌激素受体抑制剂 ICI 182780 能抑制 E2 诱导的 Daintain 的表达， 说明 ERα 参与到这个过程中。3) LPS 单独或者与 E2 协同对 Daintain 的表达无调节作用，暗示 Daintain 直接 由激素调控表达，与一般的炎症因子不同。4) 提取单核巨噬细胞系 RAW264.7 基因组 DNA，以其为模板采用 PCR 方法克 隆出 Daintain 基因 5’端 UTR 区 1.6 kb DNA 序列，将该序列同源重组到 pGL3-Basic 载 体上，成功构建含有 Daintain 基因启动子的荧光素酶报告基因载体 pGL3-Basic-DT(-1572_+59)。进一步通过酶切 pGL3-Basic-DT(-1572_+59)，回收载体、 连接，成功构建载体 pGL3-Basic-DT(-1286_+59) ， pGL3-Basic-DT(-794_+59) 和pGL3-Basic-DT(-595_+59)。Daintain 基因启动子的荧光素酶报告载体为进一步研究Daintain 转录调控作用提供了载体资源。5) 通过检测荧光素酶活性，发现 E2 对载体 pGL3-Basic-DT(-1572_+59)具有激 发活性。5’端剪切 Daintain 基因启动子后，发现 E2 对载体 pGL3-Basic-DT(-1286_+59) 活性最大，而对载体 pGL3-Basic-DT(-794_+59)和 pGL3-Basic-DT(-595_+59)没有活 性。说明 Daintain 基因启动子区-1286 bp 至+59 bp 内含有 E2 调节的活性区域。Daintain 组成性地表达于单核巨噬细胞中，但其对巨噬细胞功能的影响未研究清 楚。本文第二部分研究过表达 Daintain 对 RAW264.7 细胞增殖和细胞周期的影响， 及其对 LPS 诱导 RAW264.7 细胞的吞饮能力和抗原递呈表型变化的影响。已取得的 主要研究结果如下：1) 成功建立真核稳定转染过表达 Daintain 的 RAW264.7 细胞株。2) 发现过表达 Daintain 促进 RAW264.7 细胞更多的进入 S 期，G1 期细胞减少， 进而加快细胞周期，促进细胞增殖。3) 发现过表达 Daintain 可能通过促进 LPS 诱导 RAW264.7 细胞中 NF-кB 活性 的增强，进而促进 LPS 诱导 RAW264.7 细胞的吞饮能力，以及促进 LPS 诱导 RAW264.7 细胞向树突状细胞形态的分化，促进表面抗原分子 MHCⅡ和 CD86 的上膜量。以上研究表明 E2 对通过调节基因启动子活性来调节 Daintain 的表达；Daintain 促进 RAW264.7 细胞增殖，吞饮以及向树突状细胞分化的潜能。关键词：Daintain，17-β-雌二醇（E2），RAW264.7 细胞，细胞增殖，细胞周期，吞 饮能力，抗原递呈AbstractDaintain was identified as a novel cytokine derived from macrophages i