dog1蛋白在胃肠道间质瘤中表达及其意义word格式论文.docxVIP

独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本论文属于保密□ ，在年解密后适用本授权书。不保密□。（请在以上方框内打“√” ）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日前言组织芯片（tissuechips），又称组织微阵列（tissuemicorarrays），是近年来兴起的生物芯片的一种，是把来自不同个体的数十个甚至数百个组织标本以一定的顺序集成在一个固相载体上面所形成的组织微阵列。组织芯片具有以下三个特点：①高通量，因为一张组织芯片所包含的信息量相当于数十张甚至上百张普通切片的信息量，给了人们进行大样本研究的一种简单实用的方法。②低消耗，在一张组织芯片上不论是进行免疫组织化学，原位杂交还是原位PCR的实验，相当于以往在数百张普通切片上进行的实验，大大的节省了抗体等试剂。③快速高效，在组织芯片上进行研究不仅节省抗体，同时也节约了时间，提高了研究的效率，基于上述特点组织芯片在科研工作中得到了越来越广泛的应用。胃肠道间质瘤（gastrointestinalstromaltumorsGIST）是胃肠道最常见的，来源于间叶组织的肿瘤。由于对于GIST病理诊断很大程度上依赖组织学和免疫组织化学的检测结果，而目前主要是依靠CD117作为诊断标志物，但是，虽然在遗传学上85%的GIST都存在频发性C-kit或PDGFRA基因突变，在免疫表型上95%的GIST都表达KIT蛋白（CD117），但是仍有5%的GIST缺乏KIT的表达[1]，而目前仅仅依靠CD117作为一个诊断GIST的标志物远远不能满足临床的需要，不能使更多的患者得到正确的诊断，所以越来越多的学者开始寻找另外一种诊断GIST的分子标志物，并希望能够以其作为分子靶向治疗的另外一个靶点，使得更多的病人得到正确的诊断和治疗。DOG1蛋白就是新近发现的一种潜在的诊断GIST的敏感而特异的标志物[1]。初步的研究表明，DOG1蛋白在GIST中存在选择性的高表达。我们利用组织芯片技术和免疫组织化学技术对80例GIST进行研究，以探讨DOG1蛋白在GIST中的表达水平及其在GIST的诊断中的作用，将GIST的一系列临床病理指标与DOG1的表达进行相关性分析，分析DOG1的表达是否在评估GIST的一些生物学行为中起一定的作用。材料与方法一．实验材料材料：80 点胃肠道间质瘤组织芯片购自陕西超英生物科技有限公司，病例数为80 例，包括36 例女性，44 例男性，年龄20~77岁，平均年龄53 岁，其中30例来自胃，10例来自结肠，10例来自直肠，20例来自小肠和10例来自其他器官，危险度分级包括45例低度，21例中度和14例高度。组织芯片上每个点代表一个病例，所有病例病例均经病理医师诊断证实。试剂：CD117抗体美国ebioscience公司DOG1抗体德国leica公司SABC试剂盒武汉博士德公司PBS，枸橼酸缓冲液武汉博士德公司DAB显色试剂盒武汉博士德公司二．实验方法组织芯片的检测方法和常规方法一致，采用SABC法，按试剂盒说明书进行操作，DAB显色，以PBS代替一抗进行阴性对照，光学显微镜下观察。具体步骤如下：（1）烤片：将组织芯片置于60℃烘箱中烤蜡120分钟。（2）脱蜡：二甲苯Ⅰ10分钟二甲苯Ⅱ5分钟（3）水化：100%乙醇Ⅰ5分钟100%乙醇Ⅱ5分钟95%乙醇Ⅰ5分钟95%乙醇Ⅱ5分钟85%乙醇5分钟75%乙醇5分钟蒸馏水2分钟（4）将新鲜的以PBS配制的3%H2O2溶液滴加至组织芯片上，室温封闭10分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性，PBS洗3次，每次5分钟。（5）抗原修复：采用水浴修复法，在水浴锅中加热0.01M枸橼酸缓冲液（PH6.0）至95℃，保持温度，将组织芯片置于缓冲液中20分钟，PBS冲洗3次，每次5分钟。（6）封闭：正常山羊血清封闭液滴加至组织芯片上，室温封闭1小时，甩去多余液体，不洗。（7）滴加按适当浓度稀释的一抗，其中DOG1蛋白抗体稀释度为1︰50，CD117抗体的稀释度为1︰100，以PBS为阴性对照，置于湿盒中4℃过夜，PBS洗3次，每次5分钟。（8）滴加生物素化羊抗小鼠IgG