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2018-05-18 发布于上海
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dnmt1基因干扰对胰腺癌bxpc3细胞mir148a表达 cpg岛甲基化水平及细胞增殖的影响word格式论文.docx

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dnmt1基因干扰对胰腺癌bxpc3细胞mir148a表达 cpg岛甲基化水平及细胞增殖的影响word格式论文

摘要目的：探讨DNA甲基转移酶1（DNMT1）基因干扰对胰腺癌BxPC-3细胞miR-148a表达、CpG岛甲基化水平及细胞增殖的影响。方法：将胰腺癌BxPC-3细胞接种于DMEM培养基，置于37℃、5％CO2孵箱中进行培养。实验分3组：转染空白脂质体至胰腺癌BxPC-3细胞作为空白对照组，转染阴性siRNA作为阴性对照组，转染DNMT1siRNA作为实验组。转染48h后，采用荧光实时定量PCR（qRT-PCR）法检测BxPC-3细胞中DNMT1 mRNA相对表达量；Westernblot法检测DNMT1蛋白表达量；荧光实时定量PCR法检测miR-148a基因表达量；甲基化特异性PCR（MSP）法分析miR-148a基因启动子CpG岛甲基化水平；四甲基偶氮唑盐比色分析法（MTT）检测BxPC-3 细胞体外增殖活力。结果：（1）实验组、阴性对照组和空白对照组BxPC-3细胞中DNMT1 mRNA相对表达量分别为（0.41±0.06）、（0.99±0.06）和（1.00±0.00）；实验组DNMT1 mRNA及蛋白表达量均显著低于空白对照组和阴性对照组（P0.01）；（2）实验组、阴性对照组和空白对照组BxPC-3细胞中miR-148a相对表达量分别为（3.23±0.17）、（1.03±0.67）和（1.00±0.00）；实验组miR-148a相对表达量显著高于空白对照组和阴性对照组（P0.01）；（3）空白对照组和阴性对照组BxPC-3细胞中miR-148a基因启动子CpG岛均为甲基化阳性，而实验组miR-148a基因启动子CpG岛为甲基化阴性。（4）转染后48~120h，实验组细胞体外增殖速度较空白对照组和阴性对照组明显减慢（P0.05）；在转染后的48h、72h、96h和120h不同时间点，实验组的细胞增殖抑制率分别为12.72%、%、14.44%和18.18%。结论：DNMT1基因干扰后，胰腺癌BxPC-3细胞DNMT1表达水平下调，导致miR-148a基因启动子CpG岛发生去甲基化，从而使miR-148a基因表达水平上调，并抑制癌细胞增殖；在胰腺癌BxPC-3细胞中，miR-148a的表达受DNAII甲基化调控；DNMT1和miR-148a可作为胰腺癌基因治疗的有效靶点。关键词：胰腺癌；DNA甲基转移酶1；miR-148a；DNA甲基化；细胞增殖；RNA干扰；IIIABSTRACTObjective:ToexploretheeffectofDNMT1-siRNAonmiR-148aexpression,CpGisland methylationstatus,andproliferationofpancreaticcancerBxPC-3cells.Methods:PancreaticcancerBxPC-3cellswereculturedin DMEM at37℃and 5%CO2 incubatoranddividedintothreegroups:blankcontrolgroup,negativecontrolgroup andexperimentalgroup,whichweretransfectedwithemptyliposomes,anegativesiRNAandaDNMT1-specificsiRNA,respectively.Aftertransfectedfor48h,theexpressionofDNMT1mRNAandproteininthetransfectedcellswasanalyzedby real-timePCRandWesternblot,respectively.TheexpressionofmiR-148awas analyzedbyreal-timePCR.TheCpGislandmethylationlevelofmiR-148agenepromotor regiondetected bymethylationspecificPCR(MSP).Cellproliferationwas measuredbyMTTassay.Results:TherelativequantityofDNMT1mRNAinexperimentalgroup,negativecontrolgroupandblankcontrolgroupwere(0.41±0.06),(0.99±0.06)and(1.00±0.00),respectively.TheexpressionofDNMT1mRNAandproteininexperimentalgroupwassignificantlylowerthanthoseintheblankcontrolgroupandthenegativecontrolg