dsc2在食管癌中的表达 功能与分子调控机制的研究word格式论文.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 摘 要 迄今，作为一种常见的消化道恶性肿瘤，食管癌发生发展的分子机制在许多方面依然 不甚清楚。Desmocollin 2（DSC2）是桥粒胶糖蛋白家族的成员之一，在正常上皮细胞间的 粘附中发挥重要作用。有研究报道，DSC2 在结直肠癌等肿瘤组织中表达下降，推测会直 接破坏细胞间的桥粒连接，有损组织结构与功能的完整性。关于食管癌中 DSC2 的表达、 功能及其分子调控机制，至今未见研究报道。本课题组在前期实验中发现，在食管癌细胞， 敲降 Fascin 基因表达，伴随着癌细胞的移动侵袭能力减弱与粘附能力增强，DSC2 的表达 显著上调。提示 DSC2 在食管癌的发生发展中可能扮演着某种重要角色。因此，有必要把 该基因在食管癌中的表达、功能及其分子调控机制等重要科学问题研究清楚。基于此，在 本论文中，我们通过综合运用组织芯片、免疫组化、免疫荧光、Western blotting、RT-PCR、 RNA 干扰和真核基因表达等系列实验技术手段，就上述科学问题展开深入研究，结果详见 下述。 首先，通过 RT-PCR、免疫组化、免疫印迹等实验技术，检测 DSC2 以及桥粒钙粘素 家族其它成员在食管癌组织中的表达情况。结果发现，① 与配对的正常食管上皮组织相 比，在食管癌组织中，DSC2 mRNA 表达明显下调，而 DSC3 mRNA 表达无显著差异；对 DSC1，无论食管癌组织，还是正常食管上皮组织，表达水平均很低。② 与配对的正常食 管上皮组织相比，在食管癌组织中，DSC2 蛋白表达水平也显著下调，并表现出由胞膜异 位到胞浆的特点。统计分析结果显示，DSC2 蛋白表达，与食管癌组织分化显著正相关（P 0.05），与临床分期显著负相关（P 0.05），与食管癌患者的生存期显著正相关。提示 DSC2 表达下调可能在食管癌的发生发展中发挥着某种重要作用，检测 DSC2 表达可以警示食管 癌患者的预后。 其次，通过正反两种实验策略，探讨了 DSC2 对食管癌细胞的分裂增殖与移动能力的 影响。① 实时定量 RT-PCR 和细胞免疫荧光染色实验结果表明，不同的食管癌细胞系 DSC2 的表达水平存在差异，SHEEC 等食管癌细胞表达 DSC2 的水平较高，EC109 和 KYSE150 等食管癌细胞表达 DSC2 的水平相对较低，因此，??后续研究 DSC2 功能，提供了良好的 对比细胞模型。② 在 EC109 和 KYSE150 细胞，通过基因转染建立稳定高表达 DSC2 食管 癌细胞株。分裂增殖与移动能力检测实验结果表明，与转染空载体的对照细胞相比，DSC2 高表达的 KYSE150 细胞的移动能力显著降低，但分裂增殖能力未见明显变化；而 DSC2 高表达的 EC109 细胞的移动能力有所降低，但差异不显著，分裂增殖能力也无明显变化。 II 提示 DSC2 在食管癌细胞移动等行为中发挥作用可能还受其它因素的影响制约。③ 通过人 工合成的 siRNA 瞬时转染 SHEEC 细胞。检测实验结果表明，伴随着 DSC2 表达下调，细 胞的移动能力显著增强。因此，从多个不同角度为 DSC2 下调表达促进食管癌细胞移动提 供了确切实验证据。 再次，为研究探讨 DSC2 下调表达促进食管癌细胞移动的分子机制，分别以 DSC2 基 因稳定过表达和 RNA 干扰敲降 DSC2 表达的食管癌细胞为模型，通过免疫细胞化学和免 疫印迹等实验方法，对细胞中 β-catenin 蛋白的定位和表达水平进行检测。结果发现，① 与 对照细胞比较，KYSE150 细胞过表达 DSC2 后，在细胞总 β-catenin 蛋白无明显变化的情 况下，细胞核中的 β-catenin 蛋白明显下调； ② 敲降 DSC2 表达能够显著促进 β-catenin 蛋白的细胞核聚集；③ TOPflash 荧光素酶活性实验分析证实，KYSE150 细胞高表达 DSC2 后，TOPflash 荧光素酶的活性受到明显抑制。④ 至于 EC109 细胞，由于 β-catenin/TCF 途 径未被激活，因此，虽然高表达 DSC2，但细胞的移动和黏附能力并未发生相应显著变化。 上述诸实验结果一致说明，食管癌中，DSC2 的下调表达可能会引发 β-catenin 蛋白从浆到 核的移位，激活 β-catenin/TCF 途径，上调某些细胞移动相关基因表达，促进食管癌细胞的 移动。 最后，为了弄清楚 DSC2 的下调表达究竟受哪些因素控制，本论文又从食管癌细胞中 分别克隆了 DSC2 基因的 5′端转录调控区启动子序列和 3′端非翻译区（3′ Untranslation Region, 3′ UTR）序列。5′端转录调控区启动子序列分析发现，该区域富含 CG 二联核苷酸， 提示