dbdct致肝毒性的蛋白质组学及trx1介导的氧化应激机制分析word格式论文.docxVIP

目录中文摘要IAbstractIV前言1第一章DBDCT 腹腔注射致大鼠肝脏毒性研究3第一节、DBDCT腹腔注射致大鼠肝脏损伤模型的建立31、材料和仪器：32、实验方法：43、结果：54、讨论：7第二节、DBDCT腹腔注射致大鼠肝脏损伤的9蛋白质组学研究91、材料和仪器：92、实验方法：103、结果：154、讨论：24 第二章DBDCT 致正常肝细胞HL02细胞毒性的26 作用机制研究26 第一节DBDCT 对HL02细胞的毒性作用研究26 1、材料和仪器：262、实验方法：273、结果：294、讨论：34 第二节DBDCT 对HL02细胞的蛋白质组学研究36 1、材料和仪器：362、实验方法：373、结果：404、讨论：46第三章DBDCT 对硫氧还蛋白1（Trx1）介导的氧化应激作用机制的研究49第一节硫氧还蛋白1（Trx1）介导的信号通路研究491、材料和仪器：492、实验方法：503、结果：514、讨论：54第二节N-乙酰半胱氨酸（NAC）对氧化应激通路的影响551、材料和仪器：552、实验方法：553结果564、讨论：59主要结论61参考文献62英文缩略词71综述73参考文献80攻读学位期间发表论文情况85致谢86个人简介87DBDCT致肝毒性的蛋白质组学及Trx1介导的氧化应激机制研究中文摘要目的：建立[二-(4-氯苯甲酰异羟肟酸)二正丁基合锡](DBDCT)体内与体外的肝毒性模型，采用蛋白质组学技术分别对其作用前后蛋白质表达谱的改变进行分析及鉴定，通过对差异蛋白的验证及其功能分析，推测DBDCT 引起肝毒性的主要作用机制。通过对由差异蛋白Trx1介导的氧化应激信号通路的研究，探讨DBDCT 引起肝毒性的氧化应激作用机制及其毒性靶蛋白。方法：（1）SD大鼠腹腔注射DBDCT，并记录动物体重变化及其肝脏系数，分别检测血浆肝功生化指标，肝组织病理学变化以及锡的肝脏蓄积，以确定其对大鼠的肝脏毒性。（2）采用2-DE-TOF-TOF-MS分别对正常组和DBDCT 染毒组大鼠肝脏膜蛋白和核蛋白表达谱进行分析，鉴定及其验证。（3）分别采用MTT 法，透射电镜，比色法以及流式细胞术检测DBDCT 对HL02肝细胞的抑制活性，细胞形态变化，胞外LDH含量，细胞凋亡、周期以及胞内ROS含量，初步探讨DBDCT 对HL02细胞的毒性作用及其机制。（4）采用2-DE-TOF-TOF-MS对DBDCT 处理前后HL02 细胞总蛋白表达谱进行分析，鉴定，并采用比色法、Western blot 和RT-PCR 方法对差异蛋白的功能及其表达进行验证。（5）采用Western blot和RT-PCR方法对差异蛋白Trx1，PARK7 介导的氧化应激通路下游因子ASK1，JNK和P38进行检测；同时采用抗氧化剂乙酰-L-半胱氨酸(NAC) 与DBDCT体外共同孵育，检测细胞存活率，ROS含量及其上述因子的蛋白变化水平。结果：（1）大鼠腹腔注射DBDCT2.3、3.2、4.5 mg/kg后，动物体重逐渐增加，且随着给药次数的增加，动物出现不同程度的腹水现象，自发活动减少，嗜睡，高剂量组部分动物死亡；肝脏系数随着给药浓度的增加逐渐减少；DBDCT 中高剂量染毒组AST，AKP和ACP水平明显升高，而ALT水平随着给药剂量的增加逐渐降低；病理切片可见DBDCT 中剂量组有散发肝细胞嗜酸性变，核固缩，高剂量组被膜增生，部分肝细胞嗜酸性变，核固缩；原子吸收结果显示锡在大鼠肝脏形成一定的蓄积，且呈现明显的量效关系。（2）采用2-DE-TOF-TOF-MS 共分析并鉴定出6 个膜蛋白和10 个核蛋白，包括甘油醛-3-磷酸脱氢酶(RGD1565368)，磷脂酰乙醇胺凝结蛋白(Pebp1)，醋酸盐水解酶1(Iah1)，S-腺苷甲硫氨酸合酶(Mat1a)，谷氨酸脱氢酶1(Glud1)，翻译起始因子5A-1(Eif5a)，腺苷酸激酶2(KAD2)，蛋白质二硫化物异构酶A3(PDIA3)，丁二酸脱氢酶(DHSA)，乙醛脱氢酶(ALDH2)，谷胱甘肽S-转移酶(GSTM2)，热休克蛋白(HS90B)，二甲基甘氨酸脱氢酶(M2GD)，4-羟苯(基)丙酮酸双(加)氧酶(HPPD)，鸟氨酸转氨酶(OAT)。上述差异蛋白主要参与氧化还原/氧化应激，线粒体呼吸链电子传递，酶代谢以及氨基酸合成等生命过程。（3）体外肝毒性研究结果显示DBDCT 对HL02 细胞的IC50值为5.77μM，且细胞固缩变圆，结构模糊，核膜破裂，胞外LDH 水平明显升高。流式细胞术检测结果显示DBDCT 染毒组细胞出现不同程度的凋亡与坏死，G2/M期发生阻滞，且胞内ROS含量逐渐升高。根据上述结果初步推测DBDCT 的细胞肝毒性与细胞凋亡，周期阻滞及其氧化应激有关。（4）通过2-DE-TOF-TOF-MS对