结题报告陈涛-20110923.pptVIP

大庆龙凤湿地中嗜盐微生物的分离与初步鉴定 学生：陈涛 指导老师：阮志勇 汇报内容 1、研究背景 2、国内外研究动态 3、研究目的与意义 4、实验方案 5、实验内容及方法 6、实验步骤 7、实验结果与讨论 研究背景 嗜盐微生物（Halophiles）是生长最适盐浓度大于0.2mol/L（NaCl）的微生物，根据微生物对盐的需要可分为非嗜盐微生物、弱嗜盐微生物、中度嗜盐微生物、极端嗜盐微生物。 嗜盐菌作为一类新型的、极具应用前景的微生物资源，近年来受到人们的广泛关注，它们具有极为特殊的生理结构、代谢机制和遗传基因，可产生许多具有特殊性质的生物活性物质，在医药、食品、化学工业及环境治理等方面具有一定的应用价值。 我国拥有广阔的盐域环境和丰富的嗜盐微生物资源，目前我国已陆续在新疆、西藏、内蒙古等地开展了对中度嗜盐菌的研究和多样性的调查，并筛选得到了大量的嗜盐微生物。 大庆龙凤湿地位于黑龙江省大庆市城区中，属温带大陆性季风气候，四季分明，年平均气温4.5℃ 。湿地含盐量较高，蕴藏着丰富的微生物资源，包括嗜盐微生物。 目前关于大庆地区嗜盐微生物资源的研究较少，本研究旨在通过对大庆龙凤湿地中嗜盐微生物资源的挖掘，获得一批具有研究与应用潜力的菌株，为保护、开发和利用湿地奠定基础。 有理由相信，随着嗜盐微生物资源的不断增加，将会有越来越多的嗜盐微生物基因组被测序，由此提供丰富的基因组信息资源，对十深入揭示嗜盐微生物耐盐的分子机制，发现新的与耐盐相关的基因，以及构建耐盐菌株和作物，进行充分开发和利用湿地具有重要意义。 国内研究动态 1919，LeFevre等最早开始对中度嗜盐菌的研究，从盐渍的黄瓜上分离得到了一类群嗜盐细菌。 1935，Hof T分离出一株可在盐浓度为3%~18%内良好生长的中度嗜盐菌,命名其为Pseudomonas beijetinckii。 1956，正式使用中度嗜盐菌（Moderately halophilic bacteria）这一名词。 到1980年，只有6个符合中度嗜盐菌特征的菌种被《细菌名录》收录。 2007年，Ben Ali Gam等提出盐单胞菌科(Halomonadaceae)的新属一中度嗜盐杆菌属（Modicisalibacter），并在前人的基础上对盐单胞菌科特征的描述作进一步修改。 研究目的与意义 通过对大庆龙凤湿地中嗜盐微生物资源的分离与分析，初步了解大庆湿地中嗜盐微生物资源的多样性，为本地湿地微生物资源的保护与利用提供参考依据； 获得一批嗜盐菌株，尤其是中度嗜盐微生物菌株，对其进行初步鉴定，丰富我国嗜盐微生物资源库藏。 实验方案 研究内容 1、样品中嗜盐微生物的直接分离； 2、样品中嗜盐微生物的富集培养与分离 3、分离纯化嗜盐菌株的功能评价 4、大庆湿地样品中功能微生物的组成及分析； 5、嗜盐微生物的鉴定。 实验材料与方法 一、实验材料： 1、实验样品：本实验中样品均采集于大庆龙凤湿地（东经125°07`，北纬46°28` ），包括 6个湖底沉积物样品和3个水样，所有样本采回后，冷库密封保存。 实验材料与方法 2、培养基： 1）中度嗜盐菌培养基(halophiles moderate) 2）高盐CM培养基 3）TSA培养基 3、DNA提取试剂： TE Buffer , BL Buffer , KB Buffer , DNA Wash Buffer, Elution Buffer, Glass Beads, Lysozyme, Proteinase K , RNase A。 4、脂肪酸组成分析试剂： 皂化试剂、甲基化试剂、萃取试剂、碱洗液、饱和NaCl溶液 二、实验方法： 样品的富集培养 微生物的稀释涂布平板分离 菌株的纯化 菌落培养特征的观察 革兰氏染色与镜检 纯培养菌株的基因组DNA的提取 16S rDNA的PCR扩增 脂肪酸组成分析 菌株的保存采用真空冷冻干燥法 实验结果 1、样品富集分离结果： 对大庆龙凤湿地采集的样品，用2种不同的培养基在37℃和15℃下分离中度嗜盐菌四株，编号H1、H2、H3、H4。 分离的4株菌株来自相同的培养基，其菌落特征各异，培养2-8天后，菌落基本都呈圆形，直径在0.3—4mm之间，菌落边缘完整，表明多光滑，湿润，少数干燥，透明度从不透明到完全透明都有。颜色包括了黄、乳黄、白、无色等。 6、 16S rDNA测序与比对结果 H1： GGGGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGAACCATTGGAGCTTGCTCCTTTGGTTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCCTGCAGATCGGGATAACTC