米曲霉F16原生质体制备和再生研究.docVIP

米曲霉F16原生质体的制备和再生研究 　　[摘要]目的:研究菌龄、酶液组成、酶解时间、酶解温度、渗透压稳定剂、培养基成分等因素对米曲霉F16原生质体制备和再生的影响。结果表明,米曲霉原生质体制备和再生的最佳条件是:菌龄15h,酶液为0.75%纤维素酶、0.75%蜗牛酶、0.5%溶菌酶的混合酶液,酶解时间2.5h,温度为28℃,最适原生质体再生培养基为含有0.6mol/L NaCl的PDA培养基。 　　[关键词]米曲霉原生质体制备再生 　　 　　 　　 米曲霉(Aspergillus oryzae)是一类产复合酶的菌株,生产的酶类包括蛋白酶,淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等[1],在造纸、食品、饲料、生产曲酸、酿造等工业中应用十分广泛。在实际生产中,米曲霉的产酶能力往往欠佳。如果能对米曲霉进行人工改造以提高其酶活,将会在一定程度上提高生产效率,降低生产成本。目前关于米曲霉的育种,主要采用物理和化学的诱变方法。自Emerson[2]首次报导得到粗糙脉孢菌的类原生质体结构以来,丝状真菌原生质体的研究已经取得了长足的进步,广泛运用于真菌遗传学的理论研究和育种实践。与之相关的原生质体诱变、融合、转化等技术是如今行之有效的菌种选育方法,愈加受到人们的重视,已经有许多的成功报道[3-4]。然而原生质体制备和再生是与原生质体相关的生物技术的关键环节。因此本文对米曲霉原生质体的制备和再生条件进行研究,为基于原生质体技术基础上的融合和基因组改组技术奠定夯实的基础。 　　1材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1菌株 　　 米曲霉F16为本实验室保藏菌株 　　1.1.2 主要试剂 　　 蜗牛酶(Snailase);为厦门泰京生物有限公司产品; 　　 纤维素酶(Cellulase),溶菌酶(Lysozyme)均为国药试剂; 　　 其他常规试剂均购自上海生工和中国医药上海化学试剂公司。 　　1.1.3培养基 　　 (1)PDA固体培养基(g/L):马铃薯200;葡萄糖20;琼脂 20;pH 6.8 　　 (2)马丁培养基(g/L):KH2PO4 1;MgSO4?7H2O 0.5;蛋白胨 5;葡萄糖 10;琼脂 15-20;pH 6.8 　　 (3)查氏培养基(g/L):蔗糖30;NaNO3 3;KH2PO4 1;KCl 0.5;MgSO4?7H2O 0.5;FeSO 40.001;麸皮10;琼脂 15-20;pH 6.8 　　 (4)PMA固体培养基(g/L):葡萄糖 40;KH2PO4 1;NaNO3 2;KCl0.5;FeSO 4 0.01;MgSO4?7H2O0.5;NaCl 38;琼脂 15;酵母膏 2;PH 6.0 　　 (5)酵母膏培养基(g/L):酵母膏5;蔗糖10; 琼脂粉15 　　 (6)再生培养基:添加0.6mol/L的NaCl配制 　　1.2 方法 　　1.2.1菌丝体培养 　　 从斜面上洗下的新鲜成熟孢子,调整孢子浓度在107个/mL,转接入铺有一层无菌玻璃纸的查氏固体培养基中,每皿接种量0.2mL,于28℃恒温箱中静置培养数小时备用。 　　1.2.2酶液的配制 　　 用0. 6mol/L NaCl或其它不同渗透压稳定剂配制,经0.22μ微孔滤膜过滤除菌,保存于4 ℃ 冰箱备用。 　　1.2.3原生质体的制备与再生 　　 刮下玻璃纸上长好的菌丝体于50mL离心管中,加入10mL酶液,放置于适宜温度的水浴振荡器中进行酶解,并定时吸取少量酶解液用血细胞计数板计数。酶解完毕后,酶解液用4层无菌镜头纸过滤,除去菌丝体碎片,滤液3000r/min离心10min,除去上清液,用渗透压稳定剂离心洗涤2次后重悬浮于适量渗透压稳定剂中,得到纯化的原生质体[5]。用渗透压稳定剂对上述原生质体进行了稀释,使之达到一定的浓度,取0.2mL接种于再生培养基上,28℃恒温培养2d～3d。同时,取纯化的原生质体用无菌水适当稀释后放置30min,在未加入渗透压稳定剂的低渗固体培养基上涂布培养,作为对照,计算再生率。 　　 再生率=(再生固体培养基上菌落数-低渗固体培养基上菌落数)/原生质体数×100% 　　2结果和讨论 　　2.1菌龄的选择 　　 微生物的生理状态尤其是菌龄,是决定原生质体形成量的主要因素之一。丝状真菌分离制备原生质体时常采用年轻的菌丝,一般认为对数前期和对数期效果最好。对于丝状菌的原生质体再生来说,通常认为年轻细胞再生能力比衰老细胞要强。本实验发现当米曲霉培养时间为15h时,原生质体的形成量最大,达到1.92×106个/mL,再生率最高值出现在13h时,达到22%(图1)。综合考虑,选择15h的菌龄作为原生质体制备和再生的材料。 　　 　　图1菌龄对原生质体制备和再生的