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连续发酵的三个阶段 主讲：严涛 主要内容 一、发酵方式 二、连续发酵的三个阶段 三、连续发酵的应用及应用实例 连续发酵的三个阶段 一、菌体生长阶段 二、产物合成阶段 三、菌体自溶阶段 （一）、菌体生长阶段 菌体生长过程一般都会经历以上四个时期：迟缓期、对数生长期、稳定期、衰亡期。 （二）、产物合成阶段 此阶段主要是次级代谢产物的合成。在这个阶段中，产物的产量逐渐增多，直至达到高峰，生产速率也达到最大，直至产物合成能力衰退。生产菌的呼吸强度一般无显著变化，菌体物质的合成仍未停止，使菌体的重量有所增加，但基本不繁殖。这个阶段的代谢变化是以碳源和氮源的分解代谢和产物的合成代谢为主。 （三）、菌体自溶阶段 这个阶段一般称为菌体自溶期或发酵后期。在此阶段中菌体衰老，细胞开始自溶，氨氮含量增加，pH上升，产物合成能力衰退，生产速率大幅度下降。发酵到此阶段必须结束，否则不仅会因菌体自溶而使发酵液在过滤和提取等后续工艺中操作困难，而且产物可能会受菌体自身分泌的酶破坏。 * * 一、 发酵操作方式 分批发酵 补料分批发酵 连续发酵 （一）、分批发酵 向反应器中一次投入所需的培养基，然后接种培养，培养过程中除控制温度和pH外不进行其他任何控制，反应结束后将全部培养液排出进行处理。 （二）、补料分批发酵 介于分批发酵和连续发酵之间的操作方式； 在进行分批培养的时候，随着营养的消耗，向反应器内补充一种或多种营养物质，以达到延长生产期和控制发酵过程的目的。 （三）、连续发酵 连续培养是指以一定的速度向培养系统内添加新鲜的培养基，同时以相同的速度流出培养液，从而使培养系统内培养液的流量维持恒定，使微生物细胞能在近似恒定状态下生长的微生物培养方式。连续培养又称连续发酵，它与封闭系统中的分批培养方式相反，是在开放的系统中进行的培养方式。 下面是典型的实验室连续培养系统。 连续培养的应用： （1）细胞的生产 如单细胞蛋白（SCP）的生产 （2）代谢产物的生产 已在工业上采用连续培养的有啤酒、丙酮-丁醇等的生产； (3) 发酵动力学研究 通过连续培养，可以求得发酵动力学表达式中的某些常数， 如Ks、?max等 (4）细胞生理特性的研究 连续培养产气气杆菌细胞组成与比生长速率的关系 在分批培养中，细胞的比生长速率很难加以控制，而在连续培养中，细胞的比生长速率可以通过改变稀释率来控制，因而在连续培养的稳定状态下，可以从容地研究细胞在不同生长速率下的生理特性。 (5）培养基的改进 ◇ 连续培养也成功地用于培养基配方的改进。 原理:： 在一定的稀释率下，增加培养基中限制性基质的浓度可能有两种结果，一是仍为该基质限制，表现为在反应器中其浓度基本不变而细胞浓度明显增加；二是其他某种基质成为限制，表现为细胞浓度无明显增加而原限制性基质的浓度明显增大。 ● ○ 改进Pseudomonas 培养基配方 出发配方中碳源甲醇浓度为1g/L，达到稳态后，在1处将甲醇浓度改为2g/L，菌体浓度无增加，但反应器中甲醇浓度大大增加，表明不是甲醇，而是其他物质成为限制性因素。 在2处加入MnSO4，甲醇浓度未下降，而在3、4处加入CuSO4则甲醇浓度大大下降，菌体浓度上升，表明由铜离子限制又变为甲醇限制。如此反复尝试，可得到改良的配方，不但提高了发酵的菌体浓度，而且提高了菌体的得率。 6）菌种的筛选和富集 当多种微生物在同一反应器中混合连续培养时，各种微生物竞争利用限制性基质，从而具有优势的微生物得以保留，不具优势者则被洗掉和淘汰。 如果连续培养在敞开的反应器中进行，以土壤等材料接种，并维持一定的选择性环境，就可能富集到一定性能的微生物。 例如，以甲醇作碳源并作为限制性基质，连续培养后有可能富集同化甲醇的微生物。 7）微生物遗传学稳定性的研究 大肠杆菌W3110 (pEC901)的质粒稳定性和传代数的关系 采用连续培养，理论上微生物可以无限地生长，因而是研究其遗传稳定性的好方法。 连续培养已广泛用于基因工程菌重组质粒稳定性的研究 不同操作方式菌体及底物浓度随时间变化的情况