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果树原生质体培养和融合 一、原生质体培养的意义 原生质体（protoplast）是指通过质壁分离去除细胞壁后，由质膜所包被的裸露细胞。 1960年Cocking曾用酶法制备番茄原生质体首获成功。现已从许多植物的多种材料中制备出大量有活力的原生质体。 原生质体研究对果树某些生理遗传理论问题和育种应用都具有重要意义，主要有如下几方面： （1）作为转基因受体再生植株 Vardi等（1990）利用PEG（聚乙二醇）法将外源nptⅡ基因导入柠檬原生质体并再生成转基因植株，开创了在木本植物中应用的先例。 （2）突变体筛选 邓占鳌（1989）曾以甜橙胚性愈伤组织为材料，经-γ射线和EMS处理，获得能耐0.8%NaCl耐性系，但耐盐性尚不能稳定地保持。 （3）原生质体融合 通过异源原生质体融合，可以吸收外源遗传物质，实现体细胞杂交（somatic hybridization）、 “体—配”融合，产生遗传上修饰的细胞。 扩大了远缘杂交的范围，开辟了育种的新途径，对遗传工程研究也起到重要的作用。 （4）种质资源的保存 果树种质资源可将其胚性愈伤组织，在超低温条件下冷冻贮存，能保持其活力，因此，能在很小范围内保存大量种质。 （5）生物学基础方面的研究 原生质培养涉及到许多生物学基础研究：例如： ①细胞壁的生物合成； ②细胞膜的结构与功能； ③细胞器特性； ④细胞分裂； ⑤核质关系； ⑥抗性机制； ⑦分子生物学等。 二、原生质再生植株 （一）原生质体的制备 1. 外植体来源 原生质体分离所用的材料绝大多数为胚性愈伤组织，其诱导的途径主要有以下几方面： （1）败育的成熟胚珠培养 （2）未成熟的胚珠培养 （3）实生苗下胚轴诱导 （4）花药培养 2.原生质体的获得 为了获得原生质体，首先必须去除细胞壁。 （1）细胞壁组成： 细胞壁是由纤维素、半纤维素、果胶质及蛋白质等组成。 （2）单个细胞获得： 细胞壁与壁之间有中胶层，除去中胶层才能分离各个细胞，再除去细胞壁才能分离原生质体。 （3）除细胞壁方法： 主要有机械法和酶法两种，而最常用的是酶法。 3.酶法降解细胞壁 常用的酶有果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶，果胶酶使细胞间的果胶降解，把细胞从组织中单离出来，纤维素酶能使细胞壁的纤维素降解，从而得到裸露的原生质体。 酶液处理方法1： 将一定量的纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶组成的混合酶液处理试验用材料； 酶液处理方法2： 先将材料在果胶酶中处理一定时间后，使材料分离成单个细胞，再在纤维素酶中去壁。 制备酶液时应注意酶的种类、浓度、组成、渗透压和pH值。酶液配制质量不仅关系到细胞去壁的效果，而且也影响到原生质体的产量和活力。 （二）原生质体分离 植物原生质体的分离和发育 （三）原生质体的培养 培养原生质体可用液体培养或固体培养。液体培养时，可用2~3mm的薄层培养或悬浮培养；固体培养时，可将原生质体悬浮液与琼脂等量混合或涂抹平板培养。 一般先用液体培养，当形成细胞团后再用固体培养。也有采用双层培养法，即上面为一层培养液，下层用琼脂。不论哪种培养方法，都要求有一定的原生质体密度，一般在5×104~5×105个/ mL之间。 原生质体培养（protoplast culture）时用的培养基与细胞培养基相似，通常用NT培养基或B5培养基。 Protoplasts culture in Peach 1.protoplasts isolated from embryonic callus 2. first cell division after 5~7days’ culture 3.second cell division after 7~8d culture 4.The cell colonies formation after one month culture A. Fleshly isolated protoplasts of cucumber(×400) B. The first cell division(×160) C. Somatic clones after 10d culture (×160) D. Embryogenesis on the embryogenetic callus 三、原生质体的融合 1、化学物质诱导原生质体融合 ①Ca（NO3）2为融合剂 ②NaNO3为融合剂 ③高pH-高钙法 ④聚乙二醇（PEG）融合剂 　　高pH（9.