中检所之菌种保藏等方法的培训教材.pptVIP

无菌检查法之菌种保藏 中国药品生物制品检定所 抗生素室 微生物组 菌种和实验用菌液 枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis [CMCC（B）63 501] 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus [CMCC（B）26 003] 生孢梭菌 Clostridium sporogenes [CMCC（B）64 941] 铜绿假单胞菌 Pseudomonas aeruginosa [CMCC（B）10 104] 大肠埃希菌 Escherichia coli [CMCC（B）44 102] 白色念珠菌 Candida albicans [CMCC（F）98 001] 黑曲霉 Aspergillus niger [CMCC（F）98 003] 菌种和实验用菌液 验证用菌种的保藏 使用频繁 传代限制（5代） 菌种和实验用菌液 菌种保藏及应用参考方法： 干菌种（0代） 100ml液体培养基复苏（1代） 加100ml 40%无菌甘油混匀，1ml/管冻存管分装， -20℃或-80℃保存 每次使用取1支自然（室温）解冻，取0.1ml接种至10ml液体培养基（生孢梭菌用12ml硫乙醇酸盐流体培养基）按规定培养、稀释（2代） 菌种和实验用菌液 各实验室应根据自身操作习惯总结出一套切实可行、快速稳定的菌液制备标准程序。 菌种和实验用菌液 参考菌液制备标准程序： 取经34℃培养18-24小时的枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、绿假单胞菌与大肠埃希菌的营养肉汤培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，分别10倍稀释备用（枯草芽孢杆菌至10-5、金黄色葡萄球菌10-6、绿假单胞菌与大肠埃希菌至10-7）； 菌种和实验用菌液 参考菌液制备标准程序： 取经34℃培养18～24小时的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-7备用； 菌种和实验用菌液 参考菌液制备标准程序： 取经24 ℃培养18～24小时的白色念珠菌改良马丁培养物1ml，加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-5备用； 菌种和实验用菌液 参考菌液制备标准程序： 取经培养一周的黑曲霉菌改良马丁琼脂斜面培养物，加0.9%无菌氯化钠溶液5ml，洗下孢子，转移至另一空管，加0.9%无菌氯化钠溶液至与标准比浊管浊度相当后，取1ml加入9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，10倍稀释至10-4备用。 菌种和实验用菌液 转种操作应在超净工作台（或相当此环境）中进行，关闭风机，靠近酒精灯操作； 置23～28℃培养5～7日，培养斜面形态可参照下图； 转种完毕的冻存管和使用过的器具应经121℃湿热灭菌30分钟再作处理； 菌种和实验用菌液 菌种和实验用菌液 关于黑曲霉： 菌种和实验用菌液 菌液检验： 结合验证实验方法进行活菌计数。 生孢梭菌可在同步硫乙醇酸盐流体培养基灵敏度实验中计数。 * * 注意：已经解冻的冻存管不能再冷冻保存，以免冻融！ 关于黑曲霉： 关于黑曲霉： 图 黑曲霉（Aspergillus niger）〔CMCC（F）98 003〕改良马丁琼脂斜面 如上图，斜面正面为黑褐色厚绒状，色泽均一，不应有杂色；斜面侧面无色，接近菌层培养基略带黄色。 黑曲霉孢子相当稳定，可以保存于4 ℃ 0.9%氯化钠溶液中较长时间，作为孢子悬液储备液使用。由此可以减少菌液制备工作量和反复操作黑曲霉的风险。