egf诱导的src信号动力学的实时光学成像分析word格式论文.docx

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优秀毕业论文 精品参考文献资料 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及 取得的研究成果。尽我所知,除文中已经标明引用的内容外,本论文不包 含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出 贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明 的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名: 日期: 年 月 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,即:学校 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查 阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位 论文。 本论文属于 保密□, 在 年解密后适用本授权书。 不保密□。 (请在以上方框内打“√”) 学位论文作者签名: 指导教师签名: 日期: 年 月 日 日期: 年 月 日 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 I 摘 要* 蛋白质酪氨酸磷酸化对诸多基本细胞过程起着关键的调控作用,包括细胞生长、 粘附、增殖等。因为蛋白质酪氨酸激酶(Protein Tyrosine Kinases, PTKs)与蛋白质 酪氨酸磷脂酶(Protein Tyrosine Phosphatases, PTPs)的相互拮抗,所以一个特定蛋 白质的酪氨酸磷酸化水平是 PTKs 和 PTPs 共同作用的结果。最近研究发现酪氨酸磷 酸化过程受双氧水(Hydrogen Peroxide, H2O2)介导的氧化还原过程调节。证据显示 H2O2 可以通过氧化 PTPs 活性中心的半胱氨酸残基而抑制其活性。目前逐渐形成有 关 H2O2 在生长因子诱导的酪氨酸磷酸化信号中的作用的假说:PTKs 的激活不足以 提高蛋白质的酪氨酸磷酸化稳态水平,同时也需要内源性 H2O2 介导的 PTPs 抑制作 用的参与。虽然 H2O2 参与酪氨酸磷酸化信号通路的分子机制已经被广为接受,但 是 H2O2 是以何种方式调节酪氨酸磷酸化信号动力学过程及其特点仍不清楚,尤其 是缺乏活细胞内的实时动态调节信息;此外,在外源性 H2O2 诱导的氧化应激中, 细胞内谷胱甘肽(Glutathione, GSH)氧化还原电势与酪氨酸磷酸化动力学之间的关 系至今未见报道。 本研究使用基于荧光蛋白的荧光能量共振转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)探针 Src 探针在活细胞水平对上表皮生长因子(Epidermal Growth Factor, EGF)诱导的和 Src 激酶介导的酪氨酸磷酸化过程(简称 Src 信号)进行了 定量研究,发现内源性 H2O2 通过抑制 PTPs 活性,正向地调节 Src 信号的峰值强度 和持续时间。为了在单个细胞内对 Src 信号动力学与外源性 H2O2 诱导的细胞 GSH 氧化还原电势变化动力学进行同步研究,我们发展了基于 mVenus/mKOκ FRET 对的 Src 探针和基于单个荧光蛋白的 Grx1-roGFP2 探针的双分子成像方法,在单个细胞 中,实现了 Src 信号和氧化还原电势信号动力学变化的实时同步成像。研究显示, 在外源性 H2O2 诱导下,细胞内 GSH 氧化还原体系参与负调节 EGF 诱导的 Src 信号。 主要研究结果如下: * 国家重大科学研究计划项目(2011CB910401)、国家自然科学基金 30911120489)和新世纪优秀人才 计划(NCET-08-0220,张智红)的资助 II 1)活细胞内,在 EGF 刺激下,利用 Src 光学探针,我们得到了 Src 信号动力学。 结果显示 Src 信号动力学曲线与用生化方法得到的 EGF 诱导的细胞外信号调节 激酶(Extracellular signal-regulated kinase, ERK)信号动力学曲线类似,通过借鉴用 来描述 ERK 动力学的数学模型和参数,我们引入三个简化的参数来定量描述 Src 信 号动力学:信号峰值、信号持续时间和积分信号强度。并建立了这三个参数与 Src 活化程度和 PTPs 活性之间的关联。 2)在活细胞内,发现内源性 H2O2 通过抑制 PTPs 活性来调节 Src 的信号峰值和 持续时间。通过细胞内表达 H2O2 相关调节基因 Rac1-N17 和 Prx1-Y197F,降低内源 H2O2 水平,结果显示 Src 的信号峰值和持续时间均大大降低。而 PTPs 特异抑制剂 vanadate 能够消除此影响。 3)结果提示 EGF 诱导的内源性 H2O2 必须

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