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Exendin-4对大鼠皮质神经元缺血再灌注损伤后内质网相关性细胞凋亡的影响摘要研究背景和目的Exendin-4是一种从美洲希拉毒蜥（HelodermaSuspectum）唾液中提取的胰高血糖素样肽-1（glucagon-likepeptide-1，GLP-1）类似物，已于2005年经美国食品药物管理局（FDA）认证获准用于 2 型糖尿病患者的临床治疗。与GLP-1 相比，Exendin-4具有半衰期长、与受体结合亲和力高、易通过血脑屏障等多种优势。其与胰岛β细胞膜上的GLP-1受体（glucagonlikepeptide-1receptor,GLP-1R）特异性结合后可介导血糖依赖性降糖、促进细胞生存等多种生物学效应。GLP-1R在中枢及周围神经系统中的广泛分布，为Exendin-4在神经系统疾病治疗中的应用提供了初步的理论基础。近年来的研究表明，GLP-1R 激活后可促进细胞增殖分化、增强突触可塑性、抑制食欲、减轻体重、改善脂质代谢等。由此，Exendin-4的神经保护特性也日益受到人们的关注。目前Exendin-4的研究领域主要集中于神经退行性疾病，而其与脑血管病的相关性研究则相对较少。神经元及胰岛β 细胞均具有高度发达的内质网，对ER内稳态紊乱极为敏感。多种病理改变均可破坏内质网功能，进而触发内质网应激（endoplasmicreticulumstress，ESR）及未折叠蛋白反应（unfoldedproteinresponse，UPR）。这种细胞自我保护机制同时存在于糖尿病、脑梗死，并参与了疾病的发生发展。研究发现，Exendin-4与胰岛β细胞膜上的GLP-1R特异性结合后可激活cAMP/PKA 信号转导通路，抑制内质网相关性细胞凋亡。由此可以推测Exendin-4的抗凋亡机制可能同样适用于脑缺血再灌注损伤。如能深入探讨其相关机制，可为缺血性脑血管病的防治提供新思路。本研究旨在以原代培养的大鼠皮质神经元建立氧糖剥夺/复供（oxygen-glucosedeprivation recovery,OGD/R）离体模型模拟体外神经元缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤，观察Exendin-4对体外模拟缺血再灌注后大鼠皮质神经元ESR相关基因表达的影响，并探讨其可能机制。方法体外培养SpragueDawley乳鼠皮质神经元，随机分为对照组、模型组、治疗组，按照MTT检测结果筛选出的最低有效浓度给药。治疗组于建模前2h、建模中均给予Exendin-4；模型组于体外模拟缺血再灌注损伤（氧糖剥夺/复供，OGD/R）并给予等体积三蒸水；对照组始终正常培养。免疫荧光染色鉴定神经元纯度，RT-PCR 检测GLP-1RmRNA表达，ELISA法检测神经元细胞内cAMP水平，MTT法测定神经元存活率，Hoechest33258荧光染色及流式细胞术AnnexinV、PI双标法检测神经元凋亡率，real-time PCR 检测C/EBP 同源蛋白（C/EBP-homologous protein,CHOP）、生长抑制和DNA损伤基因34（growtharrestandDNA-damage-induciblegene34,GADD34）基因表达，免疫荧光及Western-blot免疫印迹法检测葡萄糖调节蛋白78（glucoseregulatedproteins78,GRP78）、CHOP蛋白表达。结果○1Hoechest33258检测结果显示，模型组神经元凋亡率较对照组明显增加，并随复供时间的延长而呈上升趋势（P0.05），镜下可见细胞凋亡发生的形态学改变（细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，荧光着色强）；○2RT-PCR检测结果显示，原代大鼠皮质神经元中GLP-1R 基因呈阳性表达；○3 ELISA检测结果显示，0.3μg/mlExendin-4作用后，神经元内cAMP含量迅速增加，15min达峰值，30min降至基线水平（P0.01）；○4MTT结果显示，模型组神经元存活率较对照组明显下降（P0.01），Exendin-4干预后神经元存活率提高，在0.2~0.8μg/ml浓度范围内呈剂量依赖性（P 0.01）；○5Hoechest33258法及流式细胞术AnnexinV、PI双标法检测结果均显示，ODG/R 12h时治疗组（0.4 μg/ml）细胞凋亡率明显低于模型组（P 0.01）；○6免疫荧光及Western-blot免疫印迹结果均显示，ODG/R12h 时模型组GRP78、CHOP蛋白表达增加（尤以CHOP为著），Exendin-4（0.4 μg/ml）干预后GRP78表达进一步增加，CHOP表达则降低（P 0.01）；○7real-timePCR 检测结果显示，模型组CHOPmRNA、GADD34