flavokawain a的ⅰ相代谢途径及其对细胞色素p450酶影响作用的研究word格式论文.docxVIP

原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。作学位论文者：日期：年月日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：日期：年月日摘要研究背景与目的：FlavokawainA（FKA）是从胡椒科植物-卡瓦胡椒的干燥茎、根中提取的一种具有抗肿瘤活性的新型查尔酮化合物。前期实验研究表明，该化合物毒性小，在体内分布于肝脏、肾脏和前列腺等组织中，对膀胱癌和前列腺癌的治疗尤为有效，是一个非常具有开发价值的药物前体。本文通过研究FKA对CYP450酶活性的影响；在大鼠肝微粒体中的酶促动力学和生物转化途径；及其在大鼠尿液样品中的主要代谢产物，提供FKA 的代谢实验数据。预测其在临床使用时潜在的药物相互作用，同时为查尔酮类化合物的进一步发展提供基础依据。实验方法主要包括以下4 个部分：1、FKA对CYP450同工酶活性的影响采用探针底物法，研究FKA对临床常见的药物代谢酶亚型(CYP1A2酶，CYP2D6酶，CYP3A2酶，CYP2C9酶，CYP2C19酶)活性的影响。采用SPSS17.0软件计算FKA对CYP450酶亚型的IC50值，并进一步探讨FKA对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶的抑制类型。通过分子模拟软件，模拟FKA与CYP2D6酶亚型的结合位点，验证FKA与CYP2D6 酶亚型之间的相互作用。2、FKA在大鼠肝微粒体中酶促动力学参数的测定以孵育时间、肝微粒体蛋白浓度和底物FKA 浓度为考察对象，优化FKA在大鼠肝微粒体的孵育条件，采用底物消除法计算FKA在大鼠肝微粒体中的酶促动力学参数Vmax（最大反应速率），Km（米氏常数），CLint（清除率）。3、FKA在大鼠肝微粒体中代谢途径的确认采用化学抑制剂法研究参与FKA代谢的CYP450 酶亚型。将CYP450酶亚型专属性抑制剂：CYP1A2(a-萘黄酮)，CYP2D6（奎尼丁），CYP2C9（磺胺甲恶唑），CYP2C19（奥美拉唑），CYP3A2(酮康唑)加入大鼠肝微粒体与FKA共同孵育，测定FKA的代谢率，通过比较空白对照组和不同浓度的抑制剂组中FKA的代谢率的变化，评价不同抑制剂对FKA 消除率的影响。4、FKA 代谢产物的确定采用QE-UPLC @BEH C18,Waters（100mm×2.1mm1.7μm）色谱柱测定FKA在大鼠尿液中的代谢产物。流动相A为水，B 为乙腈；流速为0.3mL/min；采用正离子模式检测，质谱采集范围m/z：200-700。I离子源参数：离子化电压为4.2 kV；毛细管温度为300℃；鞘气（40 单位）和辅助气（10单位）均为N2。一级碰撞能量为20ev，二级碰撞能量为35ev，三级碰撞能量为50ev。实验结果:1、通过探针底物法，我们研究了FKA对CYP450酶活性的影响。实验结果显示，FKA对CYP2D6，CYP2C9，CYP3A2，CYP1A2的半数抑制浓度IC50值分别为20.39μmol/L，60.22μmol/L，69.95μmol/L，102.65μmol/L。2、酶抑制动力学研究表明：FKA对CYP450酶亚型的抑制作用是可逆性抑制。对CYP2D6，CYP1A2，CYP2C9，CYP3A2的抑制类型分别是混合型抑制，竞争性抑制，反竞争性抑制，非竞争性抑制类型。3、分子模拟动力学实验结果表明: 苯丙氨酸120，精氨酸221和天冬氨酸301 在FKA 与CYP2D6酶的结合过程中起着关键性的作用。FKA 分子结构中B 环的-OCH3 与精氨酸H-NH基团形成的氢键，A环的-OH 与天冬氨酸的羰基形成的氢键以及A环和苯丙氨酸的苯环之间的π-π键都增加了FKA与CYP2D6酶结合的稳定性。4、FKA 在大鼠肝微粒体中的酶促动力学实验结果表明其最佳孵育时间为20min，蛋白浓度为1.0mg/mL，FKA底物浓度为25μmol/L。根据米氏方程计算，FKA 在大鼠肝微粒体中的Km，Vmax 和Clint 分别是22.79μmol/L，2.12 μmol/min/mg，0.093L/min/mg。