foxm1在人结肠癌侵袭 转移中的作用及其对cox2相关通路的影响word格式论文.docx

目 录摘 要 - 1 -ABSTRACT - 5 -中英文缩略词对照表 - 10 -前言 - 12 - 第一部分FOXM1 在结肠癌中的表达及功能分析 - 19 - 一、 材料与方法 - 19 -二、结果 - 40 -三、讨论 - 59 - 第二部分FOXM1 在结肠癌细胞株中对 COX-2 基因的影响 - 65 - 一、 材料与方法 - 65 -二、结果 - 68 -三、 讨论 - 73 -第三部分FOXM1 与 COX-2 在结肠癌组织中的表达及相关性分析 - 79 -一、资料与方法 - 79 -二、 结果 - 80 -三、讨论 - 83 -结论与展望 - 87 -文献综述 - 89 -摘 要结直肠癌（colorectal carcinoma，CRC）目前仍是全世界范围内危害人类健康的 重大疾病之一。CRC 在西欧、北美等发达国家尤为多见，其中，美国 CRC 的发病及 死亡率居所有恶性肿瘤的第三位，且呈逐年上升趋势。在我国，1990-2009 年间的数 据显示，在确诊 CRC 患者中男女比例为 6:4，发病高峰年龄为 50-74 岁，其发病率亦 呈上升趋势。CRC 的侵袭和转移往往是导致患者治疗失败和死亡的主要原因，转移 主要途径有直接蔓延、淋巴转移和血行播散。进一步探索其分子机制对于完善 CRC 发病机制以及探索新的治疗靶标有重要意义，因而成为目前研究的热点。叉头框蛋白 M1（fork head box M1，FoxM1）隶属于叉头框（fork head box，Fox） 转录因子家族，其在肿瘤的发生、进展及转移等相关事件中发挥重要作用。FoxM1 信号通路在细胞发育过程包括维护细胞增殖和凋亡之间的平衡起到了重要作用，其异 常改变可导致细胞癌变。FoxM1 在多种恶性肿瘤组织中异常高表达，并与多种癌基 因信号转导途径相关。特异性 FoxM1 抑制剂在肿瘤治疗方面的研究提示 FoxM1 极有 希望成为一个新的抗癌靶点。本研究首先筛选出不同 FoxM1 表达水平的结肠癌细胞株，应用 RNAi 技术及 FoxM1 过表达质粒转染结肠癌细胞，结果发现，在 FoxM1 高表达株 HT29 中下调 FoxM1 可抑制细胞增殖、侵袭及转移；而在低表达株 HCT116 细胞中上调 FoxM1 则 结果相反。进一步，我们构建了慢病毒感染结肠癌细胞株的稳定表达株，并建立移植 瘤动物模型，及观测肿瘤生长，结果同样表明，FoxM1 高表达可促进肿瘤增殖，FoxM1 低表达则对肿瘤细胞增殖、侵袭及转移有抑制作用。已发现，FoxM1 及 COX-2 在结肠癌中均高表达，但两者在结肠癌中表达的相关 性以及两者之间是否存在共同作用通路，尚未见明确报道。环氧合酶(cyclooxygenase, COX)，是前列腺素合成初始步骤中的关键性限速酶，共有 COX-1 和 COX-2 两种同 工酶，其中 COX-2 与多种肿瘤发生相关。COX-2 在肿瘤发生、转移中的主要作用表 现为抑制细胞凋亡、促进肿瘤新生血管形成、抑制免疫功能以及增加肿瘤的侵袭能力 和促进癌变。近年，COX-2 抑制剂和非甾体类抗炎药已被证明能够降低部分人群罹 患肿瘤的风险，这提示 COX-2 有可能作为恶性肿瘤的治疗性分子靶标之一。我们通过实时荧光定量 RT-PCR 及 Westen blot 方法，在 HCT-116 及 HT29 细胞 株中发现，COX-2 表达水平与 FoxM1 正相关，上调 FoxM1 表达可观察到 COX-2 基 因表达增强，而抑制 FoxM1 表达则可观察到相反结果。进一步应用免疫组织化学分 析 FoxM1 和 COX-2 在 CRC 组织中的表达，结果显示，FoxM1 和 COX-2 在结肠癌组 织中表达水平明显高于正常结肠组织，并与结肠癌的 TNM 分期和淋巴转移均相关。- 1 -这提示，FoxM1 及 COX-2 均参与 CRC 的发生及发展，并在肿瘤的浸润、转移过程中起至关重要的作用。因此，本研究提示：FoxM1 可能通过调控 COX-2 表达从而参 与结肠癌的发生、发展及转移， FoxM1 基因有望成为逆转结肠癌侵袭、转移的潜在 治疗靶点。第一部分FOXM1在结肠癌中的表达及功能分析目的：探讨 FoxM1对人结肠癌细胞生物学行为的影响。方法：通过Real-time PCR、Western blot方法，检测人结肠癌细胞株KM12SM、HT29 和HCT116以及正常结肠细胞上皮细胞株 HcoEpiC中FoxM1 基因的表达水平 差异，分别筛选出高表达株及低表达株。设计3条针对 FoxM1的 siRNA序列， 筛选出RNA干涉效果最佳的siRNA，合成RNA干涉载体（pGPH-shFoxM1）， 同时合成FoxM1基因过