基因工程基本技术 基因工程课件教学 讲义.ppt

③ Pfu DNA Polymerase ④ Taq Plus DNA Polymerase 有3 ’-5’的外切酶活性，5’-3’外切酶活性。 但PCR产物为平端！ 是目前已发现的所有耐高温DNA 聚合酶中出错率最低的。 是Taq和Pfu DNA聚合酶的混合物。 Taq的PCR产物3’端往往带有一个A。 与待扩增的模板DNA区段的两3’端序列互补（ 5‘端相同）的短DNA。 （3）引物（primer) ①位置 3’ 3’ 即2.75?1011 bp的基因组中有一次完全与19个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约2×10-11）。 ②引物的长度 理论计算： 419=2.75?1011。 一般引物设计为长15—30bp。 ③引物的碱基序列 5’端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。 5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’ 3’GCTAGCTACTTAAG5’ 3‘端必须与模板正确配对，5’端可以不配对。 template primer 尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力 ④引物的碱基组成 避免连续相同碱基排列或内部回文序列. 5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’ CTGCCAGTCTAC3’ GACGG5’ T 发卡结构 1） 2） 3）避免形成引物二聚体（dimer） 两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。 5’GGTCTGCCAGTCTAC3’ 3’CAGGACTTAGTCACT5’ primer1 primer2 ⑤引物的Tm值 Tm=（G+C)?4 + (A+T)?2 当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55 oC。 适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。 实际复性温度选择低于Tm值5 oC。 手工计算： 一般估计： ⑥引物的浓度 一般使用终浓度各0.5?mol/L。 ⑦简并引物 如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。 需要合成多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。 DNA-DNA或DNA-RNA链杂交。用放射性同位素（32P或125I）标记的DNA或RNA探针。 第三节 核酸的分子杂交 DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被趣称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为western blot。 原理：?将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。? 用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态,?如是否有点突变、扩增重排等。?? 一、Southern blot Southern blot 筛选结果 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 二、Northern blot Southern blot与Northern blot不同点 (1)转移的对象不同: Southern 印迹是将DNA转移到固相支持物上；Northern印迹是将RNA变性及电泳分离后，将其转移到固相支持物上的过程。 (2)变性方法不同: RNA电泳前不需要像DNA那样进行酶 切,但也需要变性。但是不能用碱变性，在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，不用NaOH ，因为它会水解RNA的2‘-羟基基团，导致RNA的降解 。 三、 原位杂交 对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。 需要目的基因的探针。 聚合酶链式反应简称PCR技术,能在体外快速特异地扩增所需的目地基因或DNA片段。扩增的数量是2n ，n为循环周期。 第四节 聚合酶链式反应（Polymerase chains reaction, PCR) DNA， 生命的蓝图 故事发生在1983年的春夏之交 1. PCR的发明 Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去