研究生分子生物学11.ppt

 (Molecular biology) 主讲教师: 张 涛 第一节 真核基因组DNA 的制备 一、细胞基因组DNA的提取 二、组织细胞组DNA的提取 三、DNA的纯化、定量和浓缩第二节 DNA印迹转移技术 一、电泳分离基因组DNA的酶切片段 二、DNA的转移和固定 三、预杂交和杂交第三节 放射自显影和显色反应 一、放射自显影 二、非同位素探针杂交的检测 制备基因组DNA是进行基因结构和功能研究的重要步骤，要求得到的DNA片段长度不小于100-200kb。 真核生物的一切有核细胞（包括培养细胞）都可以用来制备DNA。 提取DNA的一般原理：真核生物组织细胞在含SDS和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚：氯仿：异戊醇抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀或透析等方法进一步纯化。  一、细胞基因组DNA的提取(一)培养细胞DNA的提取1.常规法 2.快速法 [注意事项] 所配试剂的pH要准确;蛋白酶K用前应作预试验，明确活性大小。(二)血液白细胞的提取1.淋巴细胞液分离法2.低渗溶血法 （一）常规法（二）快速法[注意事项]  1)组织块取材要新鲜,应尽量剪成小碎粒. 2)所用的匀浆器须配套适中. 3)SDS在加样前要求溶解. 4)蛋白酶K要新配,用前确定其活性.  （一）DNA的纯化 在DNA提取过程中，难免混有盐类及其他有机物。这类物质的存在会影响多种限制性内切酶的活性，故需要将提取的DNA进一步纯化。现介绍较为常用的纯化方法： 1、透析法： 应用较广，特别是大分子量DNA的纯化。 2、乙醇铵沉淀法： 适用于纯化小分子量DNA。 3、精胺沉淀法：适用于少量DNA的纯化。 4、羟磷灰石柱分离单链和双链核酸：  根据羟磷灰石在低浓度磷酸盐缓冲液中与双链DNA结合而不与单链核酸结合，在低浓度磷酸盐缓冲液条件下上柱，洗脱收集单链DNA，然后再用高浓度的磷酸盐缓冲液将双链DNA洗脱下来。该法主要用来制备精简cDNA文库，分离单链和双链核酸。 [注意事项] 1、结合上的核酸，在60℃时才容易洗脱 下来，应尽量使柱子保持在60℃。 2、不同批号的羟磷灰石，其特性稍有差  异，可作预试验确定最佳浓度。 3、超过1mmol的磷酸盐将与DNA共沉 淀，故沉淀DNA前必须用Sephadex G-50柱子脱盐。 5、Seplarose CL-4B分级分离DNA6、Sephadex G-50柱法： 主要适用于PCR扩增等需要单链核酸的情况。 1、紫外分光光计检测法：适用于DNA及RNA的测定。核酸在紫外线260nm处有最大的吸收峰，蛋白质的最大吸收峰在280nm处，盐和小分子在230nm处。 经前述方法制备的DNA，应达到OD260/OD280＞1.7，OD260/OD230＞2.0。OD260/OD280比值的大小说明样品中 残存蛋白质的多少，OD260/OD230比值太小说明样品中残存核苷酸，氨基酸、酚、盐酸盐等小分子杂质。 2、塑料薄膜法： 3、琼脂糖平板法：由于DNA样品中的某些污染物，既可能参与发射荧光，也可能熄灭荧光。 为解决这类问题，可以把DNA样品和标准品点样在含有0.5μg/ml溴化乙淀的1%琼脂糖平板凝胶表面，于室温放置数小时，以使大分子污染物有机会扩散出去，然后再进行紫外观察或拍照。 1、正丁醇法：正丁醇具有吸收大量水的能力，而DNA不溶于正丁醇中。 2、聚乙二醇法：聚乙二醇同样具有吸水能力。将DNA溶液装在透析袋中，埋藏在聚乙二醇中，聚乙二醇吸水液化，DNA溶液体积减少。可通过更换聚乙二醇干粉达到浓缩的目的。浓缩后的溶液盐浓度亦可增加，可用乙醇沉淀或柱层析法除盐。 第二节 DNA印迹转移杂交技术  Southern杂交可用来检测经限制性内切酶酶切后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列。其主要步骤包括：1）基因组DNA的限制性酶切；2）将DNA片段电泳分离，经变性后转 移并固定于支持膜上；3）预杂交以除去非特异结合位点；4）以标记的探针进行杂交； 5）通过放射自显影或显色反应检查目的DNA限制性酶切片段的位置。一、大琼脂糖凝胶电泳分离基因组DNA限制性酶切片段