TGF-β1诱导人胎肺成纤维细胞分泌血管内皮生长因子以及布地奈德的调控作用.docVIP

TGF-β1诱导人胎肺成纤维细胞分泌血管内皮生长因子以及布地奈德的调控作用 【摘要】目的 应用转化生长因子(TGF-β1)刺激人胎肺成纤维细胞(HFL-1)检测血管内皮生长因子(VEGF)的表达，并观察布地奈德(Budesonide)对HFL-1分泌VEGF的干预作用。方法 采用体外培养细胞法，实验组加入不同浓度TGF-β1刺激，孵育72 h后收集细胞培养上清液，经EIA法检测VEGF含量;同时在0.5 ng/ml TGF-β1刺激下，观察应用不同浓度布地奈德对VEGF的调控。结果 低浓度TGF-β1上调VEGF的表达，但与对照组比较无显著性差异;随着TGF-β1刺激浓度加大，VEGF含量也逐渐增加，当TGF-β1浓度为0.5 ng/ml时，VEGF相对含量与空白对照组相比具有明显差异(P0.01)。10-7 mol/L布地奈德不仅能明显阻断内源性VEGF的表达，与空白对照组相比差异有统计学意义(P0.01)，还可明显下调TGF-β1诱导的VEGF分泌增加效应，与相同浓度单独TGF-β1刺激组比较，VEGF含量明显下降，二者比较具有统计学意义(P0.01)。结论 TGF-β1能够诱导HFL-1增殖及VEGF分泌增加，具有浓度依赖效应。提示TGF-β1诱导VEGF分泌增加可能是纤维化形成的重要原因之一;抑制VEGF生成及血管新生可能是布地奈德发挥抗纤维化作用的重要分子机制。 【关键词】 血管内皮生长因子;转化生长因子-β1;布地奈德;人胎肺成纤维细胞 组织损伤后的过度修复是形成肺部纤维化的重要原因，涉及到气道、肺间质和肺实质的多种疾病，尽管各疾病病理及临床特点不尽相同，但是在致病机制中均涉及到肺损伤后的修复反应〔1〕。气道慢性炎症损伤及随之而来的组织过度修复是形成气道重构的重要病理生理特点〔2，3〕，目前尚无有效的预防或逆转气道重构的措施。成纤维细胞是气道黏膜下主要结构细胞之一，其增殖和功能增强在致肺纤维化中有着重要的作用〔4〕。Blobe〔5〕等报道转化生长因子(TGF-beta;1)可促进细胞外基质蛋白的合成，在气道重构中起着至关重要的作用。血管生成是组织损伤后进行修复的必要条件之一，也是肺部纤维化的重要病理改变。血管内皮生长因子(VEGF)主要调节血管生成。有报道哮喘患者诱导痰中VEGF的表达水平增高，与气道狭窄和血管渗漏程度正相关〔6〕。Kobayashi 等〔7〕研究表明，TGF-beta;1可诱导包括VEGF在内的多种参与组织修复和重构的生长因子的表达。糖皮质激素广泛用于治疗气道非特异性炎症和肺纤维化疾病，但其治疗效果仍存在争议〔8〕。本文探讨TGF-beta;1刺激下VEGF的表达情况，以及布地奈德(糖皮质激素)干预后的调控作用。 1 材料与方法 1.1 材料及试剂 人胎肺成纤维细胞株(human fetal Lung fibroblast-1，HFL-1)，第6代，购于上海中科院，为贴壁生长细胞。主要试剂：DMEM(美国Gibco)，胎牛血清(FBS，美国Hyclone)，纯化人TGF-beta;1(英国Peprotech)，布地奈德(英国Peprotech)，人VEGF定量酶联免疫分析法(EIA)试剂盒(上海森雄)。主要仪器：CO2培养箱MCO-17A1(日本Sanyo)，酶标仪(美国Bio-Rad)。 纯化人TGF-beta;1浓度为10 pg/mu;l，分装后-70℃低温保存备用，使用前按所需浓度按比例用稀释液稀释;2times;10-6 mol/L布地奈德第一工作浓度溶解于酒精中;将第一工作液以1∶100稀释后作为第二工作液;如此再将第二工作液以1∶100稀释作为第三工作液。细胞培养上清液中酒精的终浓度不超过0.01%。 1.2 方法 1.2.1 细胞复苏、传代培养和接种 液氮罐中取出装有HFL-1细胞的冻存管，放入37℃恒温水浴箱，轻摇使之快速溶解;将细胞悬液移入塑料离心管中，加入无血清DMEM培养液10 ml，混匀后低速(800 r/min)离心5 min，小心弃上清液;再加入无血清培养液10 ml重新混匀细胞，低速(800 r/min)离心5 min，小心弃上清液;采用血球计数板计数法，活细胞率95%，以每瓶1times;106个/ml接种到25 cm塑料培养瓶，放入37℃、5% CO2孵箱培养;HFL-1为贴壁生长细胞，观察细胞生长覆盖培养瓶底壁80%以上即可以传代。血球计数板计数，然后分装接种于25 cm培养瓶，每瓶加10%FBS的DMEM 4 ml，放入培养箱中孵育。细胞传代3次后，观察细胞增殖旺盛即可接种于12孔板;培养瓶内细胞经消化、离心，以1times;106个/ml配制成细胞悬液，均匀接种于12孔板，每孔加细胞悬液总量均为2 ml;观察细胞铺满孔板达70%~80%，吸除旧培养基后加入