急性病毒性坏死病毒引物酶基因克隆、表达及相关功能研究-cloning, expression and related functions of primer enzyme gene of acute viral necrosis virus.docx

急性病毒性坏死病毒引物酶基因克隆、表达及相关功能分析摘要栉孔扇贝（ Chlamys farreri ）是我国北方沿海重要的优良养殖经济贝类 之一，其规模化养殖已有 30 多年 ，给我国山东半岛和辽东半岛等沿海地区带来 了可观的经济效益，1990 年以来，我国北方养殖海区连年暴发栉孔扇贝大规模 死亡（死亡率在 90 % 以上），从而使栉孔扇贝养殖业蒙受巨大的经济损失，严 重影响了贝类产业的可持续发展。多年研究发现，引发我国北方养殖海区栉孔扇 贝夏季大规模死亡的病原就是急性病毒性坏死病毒（acute viral necrosis virus， AVNV ），此病毒是呈球形的双链 DNA 病毒，它主要分布于扇贝外套膜、消化 腺、肠和肾脏间质组织细胞和结缔组织细胞中，任伟成等完成了 AVNV 全基因 组测序，在 AVNV 全基因组预测的潜在开放阅读框（open reading frames，ORF） 中，发现与 AVNV 的 DNA 复制、核酸修饰与代谢及病毒与宿主相互作用相关的 ORF 有 44 个。其中 ORF 024 编码的引物酶基因参与病毒 DNA 复制。引物酶（ primase ）是一种存在于生物及病毒体内的 RNA 聚合酶，它与 DNA 的复制 和病毒活性密切相关。为确定 ORF 024 能否编码特定的、具有功能的引物酶， 以及编码的引物酶是否在 AVNV 中感染、复制以及在急性病毒性坏死症（acute viral necrosis Disease，AVND）暴发中发挥作用，作者根据 AVNV 引物酶基因设 计特异性引物进行扩增 AVNV 引物酶 ORF 024，并构建引物酶基因的原核表达 载体，在 E.coli中进行原核表达、纯化并对重组引物酶进行酶学活性分析。然后 利用绿茶提取物（茶多酚）对 AVNV 引物酶的抑制作用，来探讨茶多酚抗病毒 的作用机理。此外，利用 AVNV 感染栉孔扇贝，通过相对实时荧光定量 PCR 分 析不同组织在不同时间的引物酶基因表达情况，在 mRNA 水平上进行转录与时 序表达分析，探讨 AVNV 引物酶基因对 AVNV 在扇贝体内复制的影响，同时在 AVNV 病毒提取液中加入茶多酚再进行感染栉孔扇贝，通过实时荧光定量 PCR 分析不同组织在不同时间的引物酶基因表达，探讨茶多酚对 AVNV 在扇贝体内 复制的抑制及其抑制效率，从而为茶多酚可能的抗 AVNV 作用机理提供理论依 据。1．AVNV 引物酶基因的克隆及原核表达。根据 AVNV 基因组序列，设计特 异性引物，扩增编码 AVNV 引物酶的 ORF 024，经 1 % 琼脂糖凝胶电泳得到一条约 1050 bp 大小的条带，双酶切后将其连接至 pET32a 中构建重组原核表达载体 pET32a-prim ，并将其转化至感受态细胞 BL21（DE3）中，加 IPTG 至终浓 度 1mmol/L，诱导 4-5 小时后，SDS电泳得到一条约 60 KDa 的条带，经 Western-blotting 及质谱分析确定为重组引物酶。2．重组引物酶的纯化及酶学活性分析。利用 Co2+ 亲和层析柱对表达的重组 引物酶进行纯化，并测定纯化的重组引物酶的活性、底物特异性、不同金属离子 及 EDTA 对其活性的影响。结果表明：在以 poly（d C）为单链模板时，重组引 物酶对随机引物的合成具有一定的催化活性；AVNV 引物酶具有较强的底物特异 性，能特异性催化 GTP 水解；Zn2+、Na+、K+ 和 Mg2+ 这四种金属离子对重组引 物酶的催化活性具有促进作用，Zn2+ 浓度为 0.1 mmol/L 时促进率为 5 % ，Na+ 浓 度为 5 mmol/L 促进率只为 3 % 。而 Mn2+ 对重组引物酶的催化活性具有明显抑 制作用；EDTA 对重组引物酶的催化活性具有抑制作用，浓度越高，抑制率越强， EDTA 浓度为 10 mmol/L 时，抑制率达 12.20 % 。3．利用在引物合成反应体系中加入不同浓度的茶多酚溶液，探讨茶多酚对 体外重组引物酶活性和引物合成的影响，在茶多酚 7.81 μg/ml、31.25 μg/ml 和 125 μg/ml 的浓度作用结果如下：引物酶活性抑制率随茶多酚浓度升高而逐渐增 加，浓度 125 μg/ml 时的抑制率达 15.03 % ；引物合成的量随茶多酚浓度升高而 逐渐增加，浓度 125 μg/ml 时的促进率达 11.79 % 。4．通过 AVNV 病毒粗提液和混合茶多酚的病毒粗提液分别感染栉孔扇 贝，利用实时荧光定量技术进行引物酶基因的转录时序分析。分别取感染 AVNV 病毒和感染混合茶多酚的 AVNV 病毒 0，4，8，16，24，36，48 和 72 h 后栉孔 扇贝的外套膜和鳃，提取总 RNA，反转录