急性病毒性坏死病毒两种功能基因的克隆 表达及功能分析-cloning, expression and functional analysis of two functional genes of acute viral necrosis virus.docx

急性病毒性坏死病毒两种功能基因的克隆、表达及功能分析Cloning，expression and the studies of functional of acute viral necrosis virus two functional genes学位论文完成时间：_ 指导教师签字：_ 答辩委员会签字：_急性病毒性坏死病毒两种功能基因的克隆、表达及功能分析摘 要急性病毒性坏死病毒（acute viral necrosis virus, AVNV）是 20 世纪 末导致我国北方沿海栉孔扇贝大规模死亡的的重要致病病原。随着 AVNV 的全基因组序列的测定完成，确定该病毒全基因组序列一共包 含 123 个可能的开放型阅读框(open reading frames, ORF)，其中的 44 个开放型阅读框具有一定的结构和功能。本论文通过基因克隆、原核 表达、真核表达以及体外功能分析等技术研究其中两种功能基因的功 能，这对了解 AVNV 的侵染机制和致病机理，从而为 AVNV 的防控提 供有效理论依据。研究内容和结果如下：第一部分：通过基因克隆技术得到了 AVNV ORF86 编码的杆状病毒凋 亡抑制蛋白基因（IAP-86），将 IAP-86 基因与 pET32a（+）质粒连接构 建得到重组质粒 pET32a-IAP86，之后将重组质粒转化到 E.coil BL21（DE3）中，使用终浓度 0.1%的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进 行蛋白诱导表达，SDS检测显示表达蛋白分子量约为 40ku，经 Western-blotting 和质谱分析证明该蛋白即为 IAP-86 融合蛋白，Co2+柱 纯化后得到了纯化的的 IAP-86 融合蛋白。 第二部分：对原核表达得到的 IAP-86 蛋白进行功能性分析，首先将重I组的 IAP-86 蛋白用 FITC 标记，荧光显微镜下观察，发现重组的 IAP-86蛋白最终能够与栉孔扇贝血淋巴细胞的细胞核和细胞质结合，提示重 组的 IAP-86 蛋白能够进入到细胞内发挥作用。使用细胞凋亡检测试剂 盒针对 IAP-86 的抗凋亡作用进行分析，实验结果证实重组的 IAP-86 蛋白能够在一定程度上抑制栉孔扇贝血淋巴细胞凋亡，凋亡抑制率在 7%左右。 第三部分：为深入探讨魁蚶中检测到的急性病毒性坏死病毒（acute viral necrosis virus, AVNV）魁蚶株的致病机理以及进一步研究 IAP-86 蛋白 的功能，本实验从感染 AVNV 的濒死魁蚶外套膜中提取总 RNA，反转 录获得 cDNA。根据 NCBI 公布的 AVNV 全基因组序列中 ORF86 序列 设计两对反向套式引物，通过 cDNA 末端快速扩增（RACE）技术获得 ORF86 5’端和 3’端的非编码区，拼接获得全长 cDNA 序列。Blast 序列 比对显示，该基因与牡蛎疱疹病毒的相似性为 100%，与栉孔扇贝 AVNV 的相似性为 99%，并存在重叠基因。生物信息学分析预测该蛋白不含 有信号肽，不存在跨膜区，最大疏水指数为 1.800，最小疏水指数为-3.456。存在 8 个潜在的磷酸化位点（包括 5 个丝氨酸、1 个苏氨酸和2 个酪氨酸），存在 1 个潜在的 O-糖基化位点，不存在潜在的 N-糖基化 位点；其抗原表位主要集中在 8-11、14-16、28-39、75-76、88-95、97-100 和 147-158 位氨基酸。第四部分：在使用原核表达技术对 AVNV 解旋酶进行表达未获得成功 的前提下，尝试使用酵母表达系统对 AVNV 解旋酶进行真核表达，本II部 分 通 过 基 因 克 隆 技 术 获 得 了 表 达 AVNV 解 旋 酶 的 开 放 阅 读 框-ORF66，并将该基因连接到 pPIC9K 表达载体上，构建获得了真核表 达载体 pPIC9K-ORF66。关键词：栉孔扇贝，急性病毒性坏死病毒，IAP-86，原核表达，抗凋 亡，cDNA 末端快速扩增技术，SF2 helicase,真核表达Cloning，expression and the studies of functional of acute viral necrosis virus two functional genesABSTRACTAcute viral necrosis virus( AVNV) was reported as the causative agent responsible for summer mass mortality of adult Zhikong scallop( Chlamysfarreri)，which is widely cultured along northern China co