急性乙型肝炎患者hbv特异性cd8t淋巴细胞受体α和β链取用的研究-study on the extraction of α and β chain of hbv - specific cd80 lymphocyte receptor in patients with acute hepatitis b..docx

I I 急性乙型肝炎患者 HBV 特异性 CD8+ T 细胞受体 α和β链取用的研究 中文摘要 全球有超过 3.5 亿 HBV 慢性感染患者，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）感染可引起急慢性肝炎，肝硬化及肝细胞癌等，严重危害着人类的 健康。虽然乙型肝炎的发病机制仍不完全清楚，病毒的清除涉及到很多因 素，如机体本身，病毒，以及机体免疫反应应答能力等，但目前研究比较 一致认为，HBV 是非直接致细胞病变病毒，它自身并不引起肝细胞损害， 肝脏的损伤是由免疫应答反应所致，其中特异性 CD8+ T 淋巴细胞即特异性 细胞毒 T 淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）免疫应答反应在清除 病毒和决定疾病转归中发挥重要作用。急性乙型肝炎患者体内存在较强的 多特异性 CTL 反应，对清除感染病毒发挥关键作用，同时也与免疫病理损 伤的程度和类型密切相关；而慢性乙型肝炎患者的外周血中往往 CTL 反应 很弱或针对的病毒抗原表位单一，是 HBV 不能被及时清除的重要因素。引 起这种 HBV 特异性 CTL 反应差异的分子机制目前尚不完全清楚。由于 CTL 的特异性取决于细胞表面的 T 细胞受体（T cell receptor，TCR），而 TCR 的特性主要决定于?和?链可变区（V 区）的分子组成，因此，揭示特异性 CD8+ T 细胞的 TCR 分子的组成特性十分重要。本研究的目标是分析急性乙 肝患者 HBV 抗原表位特异性 CD8+ T 细胞 TCR ?和?链的取用特点，帮助阐 明急性乙型肝炎患者特异性细胞免疫应答的特点及其分子机制，同时获取 II II 特异性 CD8+ T 细胞 TCR ?和?链可变区的序列信息，帮助阐明 HBV 的免疫 致病和免疫清除机理，并为乙型肝炎的免疫治疗提供支持。 目的 1. 建立一种高效扩增人 T 细胞受体（TCR）α 和 β 链可变区基因 的方法。 2. 分析急性乙型肝炎患者外周血中HBV特异性CD8+ T细胞的频率。 3. 分析急性乙型肝炎患者HBV特异性CD8+ T细胞受体Vα和Vβ亚家族 特点。 方法 1. 根据 32 个 TCR Vα 和 25 个 TCR Vβ 亚家族基因序列特点，分 别设计 Vα 基因的上游内、外引物各 42 条以及 Vβ 基因的上游内引物 34 条、 上游外引物 37 条。在 α 链以及 β 链的恒定区（C 区）设计下游内、外引物 和测序引物各 1 条以及扩增 Cα 和 Cβ 基因的上游引物各 1 条。提取正常人 CD8T 细胞的 RNA，用 PolyA 介导反转录后，采用巢式 PCR 扩增正常人 CD8 T 细胞 32 个 Vα 和 25 个 Vβ 亚家族基因，并用 Jurkat T 淋巴瘤细胞作 为对照。用 T-easy 载体克隆 PCR 产物，对克隆基因进行测序。 2. 运用 MHC 肽五聚体法结合流式细胞技术检测急性和慢性乙型肝炎 患者外周血 HBsAg335-343 和 HBsAg183-191 抗原表位特异性 CD8+ T 细胞 频率；同时分析急性乙型肝炎患者特异性 CD8+ T 细胞的频率分别与血清 ALT 水平及病毒载量之间的关系；动态分析急性乙型肝炎患者外周血的 HBsAg335-343 特异性 CD8+ T 细胞的频率变化。 3. 从 3 例 HLA*0201 急性乙型肝炎患者的外周血分离外周血单个核细 胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC），用 HBsAg S335-343 抗原 表位多肽和细胞因子刺激 PBMC 以诱导抗原表位特异性 CD8+ T 细胞的增 殖，用流式细胞仪分选特异性 CD8+ T 细胞到 96 孔培养板，培养 10~14 d 后，提取细胞的 RNA，PolyA 介导反转录，巢式 PCR 扩增 TCR Vα 和 Vβ， 并用 3 例患者的非特异性 CD8+ T 细胞作为对照。对扩增产物分别进行直接 PAGE PAGE IV 测序和克隆测序分析。 结果 1. 从正常人的 CD8 T 细胞中扩增到所有 TCR Vα 和 Vβ 亚家族基 因，克隆后测序与相应的参考序列同源。从 Jurkat 细胞扩增出 TCR Vα1 和 Vβ8 基因，经测序验证与文献报道一致，且最少可从 10 个细胞提取的 RNA 模板中扩增成功。 2. 急性乙型肝炎患者的 HBsAg335-343 特异性 CD8+ T 细胞的阳性率 为 0.45%±0.52%，HBsAg183-191 特异性 CD8+ T 细胞阳性率为 0.19%± 0.22%。慢性乙型肝炎患者的 HBsAg335-343 特异性 CD8+ T 细胞阳性率为 %±0.04%，HBsAg18