集胞藻藻胆蛋白降解的蛋白酶分析-protease analysis of phycobiliprotein degradation in polycystis sp..docx

HtrA 在藻胆体降解过程中的水解作用是独立于 NblA 和 NblB 的。研究结果还显示两种金属离子对酶活性基本没有影响，并无促进作用。 通过体外复合物研究可以确认 HhoA、HhoB、HtrA 和 CtpA 四种蛋白酶与 CpcA、NblA 和 NblB 之间未能形成复合物，由此可以确认，NblA 造成的酶活性抑制来自 NblA 与藻胆蛋白亚基之间形成的复合物，并非其与蛋白酶之间形成的复合物。HhoA 与缺氮培养藻上清中的藻胆蛋白也不能形成复合物，故推测在 HhoA 与藻胆蛋白的 降解作用中必然存在某种辅助因子的作用，但是该辅助因子并非 NblA 和 NblB。最后通过荧光定量 PCR 实验分析集胞藻中 13 个蛋白酶基因在缺氮培养不同时 段表达量的变化，根据试验结果推测 pepP 与藻胆体降解的早期启动有密切关系， hhoB、htrA、ftsH、sppA 和 hhoA 这 5 个基因可能在藻胆体降解的中后期发挥作用， 其余 7 个基因 clpP、ape2、sll2008、ctpA、ymxG、gcP、clpB 可能与藻胆体的降解 过程无关。本论文还包括另外两个研究内容，一是对蓝藻藻胆体核-膜连接蛋白 ApcE 缺失 突变体的体外自催化重组研究，构建鱼腥藻 Anabaena. sp PCC 7120 别藻蓝蛋白 ApcE(1-240)的一系列 N 端缺失突变体基因，在大肠杆菌中进行高效表达，对脱辅基蛋 白与藻蓝胆素（PCB）的体外自催化重组进行了研究，结果表明：在含有 4 mol/L 尿素 的磷酸钾缓冲体系中，ApcE(25-240)脱辅基蛋白可与藻蓝胆素体外重组实现共价连接， 其余 6 个缺失突变体蛋白仅能与藻蓝胆素进行非共价连接，不能发生自催化重组。二是集胞藻 Synechocystis sp. PCC 6803 藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白各亚基的体内生 物合成研究，利用多质粒组合进行体内重组，将 apcA、apcB、cpcA 和 cpcB 对应的 脱辅基蛋白分别与裂合酶 CpeS、CpcE/F 或 CpeT 以及血红素氧化酶 HO1、胆绿素 还原酶 PcyA 在大肠杆菌中共同表达，从而得到具有光学活性的色素蛋白 PCB-ApcA、 PCB-ApcB、PCB-CpcA 和 PCB-CpcB，实现藻胆蛋白亚基的体内生物合成。关键词：蛋白酶藻胆蛋白藻胆体降解重组色素蛋白体外重组 体内重组AbstractNutrient deficiency causes a dramatic change of cyanobacteria in cell color from normal blue-green to yellow-green, which is known as bleaching or chlorosis. This bleaching is mainly due to the degradation of phycobilisome (PBS). NblA appeared to play the key role in PBS degradation process. It is poorly understood that how NblA leads to PBS degradation and what proteases play roles in this process. It is assumed that a protease should be found to degrade phycobiliproteins and further proteins or cofactors may be necessary for PBS degradation. Deg proteases (HhoA, HhoB and HtrA) and CtpA are important proteases in cyanobacteria. Little is known about functional relationships between these proteases and PBS degradation mechanism. In the paper, roles of Deg and CtpA proteases in the degradation of phycobiliproteins were studied.The cyanobacterial proteases HhoA, HtrA, HhoB and CtpA in Synechocystis PCC 6803 were first cloned and expressed in this work. After deletion