gst融合蛋白亲和色谱法分析转录因子ap2α与tes蛋白的相互作用-analysis of interaction between transcription factor ap2α and tes protein by gst fusion protein affinity chromatography.docxVIP

摘要亲和色谱又称为亲和层析,是一种利用与固定相高度特异结合（如抗原与抗体、 酶与底物、受体与配基的结合等）的特性将特定组分从混合物中分离出来的色谱方 法，常用于生化大分子的分离与纯化。亲和色谱法的出现大幅提高了蛋白质纯化的 速度与效率，同时也为蛋白质潜在相互作用伙伴研究（如 pull-down、共纯化）提供 了技术平台。Pull-down 技术的基本原理是用固相化的亲和配基捕获细胞裂解液中的 带有纯化标签（该标签能与固相化配基特异结合）的融合蛋白，再以此为“诱饵”， 钓取与之相互作用的蛋白。固相化的“诱饵”蛋白可以用来试探与多种来源的（可 疑的或完全未知的）“猎物”蛋白的相互作用关系，从而判定“诱饵”和“猎物” 两个蛋白质之间是否存在相互作用。本研究采用改良的亲和色谱法成功分离纯化了 AP-2α 和 TES 这两类目的蛋白， 并且利用 GST 融合蛋白亲和色谱技术(pull-down)分析了这两类蛋白之间的相互作用 关系。转录因子通过对细胞内外刺激作出反应来调节基因的表达，它们常常通过控制 基因转录的基本机制在决定细胞的命运中起主要作用。AP-2α 作为一类重要的转录 因子 AP-2 家族的成员，具有组织表达特异性和 DNA 结合特异性。最近很多研究表明， AP-2α 通过与其它蛋白的相互作用在胚胎发育，细胞分化，肿瘤发生等方面发挥重 要作用，转录调控多个下游靶基因。在本室先前的实验中，以 AP-2α 为饵蛋白，用 酵母双杂交系统筛选 HeLa 细胞 cDNA 文库得到的阳性克隆中发现了 TES。人类 TES 基 因在基因组中位于 7q31.2,近来很多报道表明该基因可能是一个潜在的肿瘤抑制基 因。TES 基因编码一个含有 421 个氨基酸残基的蛋白质序列，其蛋白 N 端是一个 PET domain，C 端则是三个紧邻的 LIM domain。为了研究 TES C 端各 LIM domain 的功能， 确定 AP-2α 与之相互作用的具体位点，本文在含有 TES 基因全长编码序列的载体 pCMV-HA-TES 的基础上，用 PCR 扩增并克隆了 TES C 端含有的三个 LIM domain 编码 序列。将得到的片段亚克隆入原核表达载体 pQE-N1，构建了表达质粒 pQE-N1-LIM 1、 pQE-N1-LIM 2 和 pQE-N1-LIM 3。在大肠杆菌 E.coli BL21 中表达 His 融合蛋白并用 基于 Ni2+ 的固定金属离子亲和色谱对表达产物进行了纯化。用同样的方法构建编码 AP-2α 各蛋白片段的表达质粒并转入大肠杆菌 E.coliBL21，表达产物为与谷胱甘肽-S-转移酶融合的融合蛋白。菌体经超声破碎后,上清 液用谷胱苷肽琼脂糖 4B 凝胶珠亲和色谱法纯化，产物纯度在 90%以上。然后用自制的抗-His-TES 抗体，通过 GST Pull-down 技术分析了 TES C 端的三 个 LIM domain 与 AP-2α 各片段之间的相互作用。实验结果表明，AP-2α 蛋白与 TES 蛋白之间存在相互作用，是由于 AP-2α C 端能与 TES C 端的第一个 LIM domain 结 合；同时根据 AP-2α 蛋白只能与 TES C 端而不能与 TES 全长蛋白结合的实验事实提 出了 TES 蛋白存在自身相互作用的可能，导致 TES 蛋白至少存在开放（open）和封 闭（close）两种折叠构像。即位于 TES 蛋白 C 端的 LIM domain 可与 TES 蛋白自身 N 端的 PET domain 发生直接相互作用，封闭了位于 TES LIM domain 1 上的 AP-2α 结 合位点，使 TES 蛋白处于封闭的构像，而不能与 AP-2α 发生相互作用。关键词：AP-2α；TES 基因；LIM 结构域；亲和色谱；相互作用ABSTRACTAffinity chromatography (i.e., affinity purification) is a method of separating biochemical mixtures, based on a highly specific biologic interaction such as that between antigen and antibody, enzyme and substrate, or receptor and ligand. Affinity chromatography methodologies greatly enhance the speed and efficiency of protein purification and simultaneously provide the technolog