(食品微生物检验)0701 分子生物学技术知识在食品微生物检测中的应用.ppt

3.5 基因芯片技术存在的问题与展望 基因芯片技术的研究和应用前景十分诱人, 但作为一项新技术, 仍有一些问题需要解决: ①该技术需要大量的已测知的、准确的DNA、cDNA 片段的信息, 他们使该技术成为大规模、集成化和整体获取生物信息的有效手段; ② 由于芯片制作工艺复杂, 信号检测也需专门的仪器设备, 一般实验室难以承担其高昂的费用; ③样品制备和标记比较复杂, 没有一个统一的质量控制标准; ④ 实验室不能共享数据和资料库等。这些都在一定程度上限制了基因芯片技术在食品检测中的应用。 基因芯片技术尽管存在一定的不足和局限, 但该技术具有检测系统微型化、检测样品微量化的特点, 同时兼具检测效率高、能同时分析多种基因或诊断DNA 序列的优势, 很适于食品中病原微生物和转基因成分的检测及鉴定。随着研究的不断深入和技术的完善, 基因芯片技术一定会在食品科学研究领域发挥越来越重要的作用。 4、DNA 指纹图谱技术 4.1 以电泳为主导技术的DNA图谱技术 4.1.1 变性梯度凝胶电泳标记技术（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE） DGGE技术检测核酸序列是通过不同序列的DNA片段在各自相应的变性剂浓度下变性，因解链行为不同，使不同序列的DNA片段滞留于凝胶的不同位置，经过染色后可以在凝胶上呈现为分散的条带。DGGE技术被广泛应用于分析食品中微生物分离和鉴定及其相关产品的微生物群落种群数量动态变化。 2004 年J.Theunissen 和T.J.Britz等人对南非益生菌食品进行了抽样检查，他们用DGGE 法确认了食品中的微生物 Milica Nikolic 等人通过PCR- DGGE 的方法成功鉴定了当地自制山羊奶干酪中的乳酸菌。 分子生物学技术在食品微生物检测中的应用 核酸的发现 1869年，F.Miescher从脓细胞中提取到一种富含磷元素的酸性化合物，因存在于细胞核中而将它命名为“核质”(nuclein）。但核酸(nucleic acids）这一名词在Miescher发现“核质”20年后才被正式启用，当时已能提取不含蛋白质的核酸制品。早期的研究仅将核酸看成是细胞中的一般化学成分，没有人注意到它在生物体内有什么功能这样的重要问题。 DNA遗传物质 1944年，Avery等为了寻找导致细菌转化的原因，他们发现从S 型肺炎球菌中提取的DNA与R型肺炎球菌混合后，能使某些R型菌转化为S型菌，且转化率与DNA纯度呈正相关，若将DNA预先用DNA酶降解，转化就不发生。结论是：S型菌的DNA将其遗传特性传给了R型菌，DNA就是遗传物质。从此核酸是遗传物质的重要地位才被确立，人们把对遗传物质的注意力从蛋白质移到了核酸上。 DNA双螺旋 1952年，奥地利裔美国生物化学家查伽夫（E.chargaff，1905— ）测定了DNA中4种碱基的含量， 发现其中腺嘌呤与胸腺嘧啶的数量相等，鸟嘌呤与胞嘧啶的数量相等。这使沃森、克里克立即想到4种碱基之间存在着两两对应的关系，形成了腺嘌呤与胸腺嘧啶配对、鸟嘌呤与胞嘧啶配对的概念。 1953年2月，沃森、克里克通过维尔金斯看到了富兰克琳在1951年11月拍摄的一张十分漂亮的 DNA晶体X射线衍射照片，这一下激发了他们的灵感。他们不仅确认了DNA一定是螺旋结构，而且分析得出了螺旋参数。他们采用了富兰克琳和威尔金斯的判断，并加以补充：磷酸根在螺旋的外侧构成两条多核苷酸链的骨架，方向相反；碱基在螺旋内侧，两两对应。一连几天，沃森、克里克在他们的办公室里兴高采烈地用铁皮和铁丝搭建着模型。1953年2月28日，第一个DNA双螺旋结构的分子模型终于诞生了。 双螺旋模型的意义 探明了DNA分子的结构 更重要的是它还提示了DNA的复制机制：由于腺膘呤(A)总是与胸腺嘧啶(T)配对、鸟膘呤(G)总是与胞嘧啶(C)配对，这说明两条链的碱基顺序是彼此互补的，只要确定了其中一条链的碱基顺序，另一条链的碱基顺序也就确定了。 DNA复制主要包括引发、延伸、终止三个阶段。 DNA的生物合成 DNA复制的过程 DNA双螺旋的解旋 冈崎片段与半不连续复制：因DNA的两条链是反向平行的，故在复制叉附近解开的DNA链，一条是5’—〉3’方向，另一条是3’—〉5’方向，两个模板极性不同。所有已知DNA聚合酶合成方向均是5’—〉3’方向，不是3’—〉5’方向，因而无法解释DNA的两条链同时进行复制的问题。 为解释DNA两条链各自模板合成子链等速复制现象，日本学者冈崎等人提出了DNA的半连续复制模型。 DNA复制所需的蛋白质和酶： 酶和蛋白质 作用 拓扑异构酶 帮助解开复制叉前后的超螺旋结构 DNA解旋酶 揭开螺旋 Rep蛋白 帮助揭开双螺旋结构 引物合成酶 合成RNA引物 单链结合蛋白 稳