issr标记对广西产鸡血藤遗传多样性及其混伪品鉴别的分析-analysis of issr markers on genetic diversity and identification of adulterants of spatholobus suberectus in guangxi.docxVIP

中 文 摘 要目 的： 本文开展对广西产鸡血藤及其混伪品的 ISSR 指纹图谱与遗 传多样性研究，为鸡血藤的品质鉴定与评价提供分子水平的理论依据， 以期为临床的安全有效使用提供保障，也为广西产鸡血藤的质量评价体 系的完善提供帮助。方法： 在广西区内共采集 9 份正品鸡血藤，其中 5 份栽培品，4 份 野生品。同时采集了 5 种鸡血藤常见混伪品，分别为豆科植物网络崖豆 藤（Millettia reticulate Benth.）、香花崖豆藤（Millettia dielsiana Harms.）、 白花油麻藤（Mucuna birdwoodiana Tutcher.）、大果油麻藤（Mucuna macrocarpa Wall.）、常春油麻藤（Mucuna sempervirens Hemsl．），并对正 品与这 5 种混伪品从形状、颜色、大小（直径）、表面特征、树脂状分泌 物以及偏心性环纹数这几个方面进行了分析比较。在 DNA 分子标记方 面，利用 9 种 DNA 提取方法对鸡血藤 DNA 进行了提取，鸡血藤常见混 伪品中白花油麻藤、常春油麻藤、大果油麻藤均为油麻藤属植物，常用 的 CTAB（C16H33(CH3)3NBr 十六烷基三甲基溴化铵）提取法未能提取出 油麻藤属植物的 DNA，且有文献曾报道在提取鸡血藤的混淆品种白花油 麻藤时，由于不同植物存在不同次级代谢，该法得到的 DNA 无法进行 PCR（polymerase chain reaction 聚合酶链式反应）扩增。因此，我们提 取油麻藤属植物 DNA 时，在植物基因组 DNA 提取试剂盒法基础上进行 进一步的优化，对提取出的 DNA 进行电泳检测得 DNA 指纹图谱，并对 结果进行分析。随之，采用 ISSR 方法进行广西产鸡血藤与其混伪品的真 伪鉴别。并采用 RAPD（随机扩增多态 DNArandom amplified polymorph ism DNA）方法与 ISSR 方法对广西产不同居群的鸡血藤进行遗传多样性 分析。结果 ：1、性状比较方面：正品与混伪品从性状特征来看，主要是树 脂状分泌物色泽的差异以及偏心性环纹数的不同。正品鸡血藤的偏心性环纹较多，而混伪品仅有 1-2 个，其他方面无特别明显的区别。2、DNA提取方面：比较 9 种方法提取出的鸡血藤 DNA 的质量，最终选定植物基 因组 DNA 提取试剂盒法为鸡血藤 DNA 的提取方法，该法简便快捷，易 于操作，且结果稳定，提取出的 DNA 可为后续 PCR 反应提供稳定模板。 对于油麻藤属植物，最终选定植物基因组 DNA 提取试剂盒改良纯化法来 去除油麻藤属植物中干扰 DNA 质量的多酚类物质等次生代谢产物，提出 的 DNA 质量好，纯度高，为油麻藤属植物 DNA 的最佳提取方法。3、ISSR 法鉴别广西产鸡血藤与其混伪品方面：从 13 条 ISSR 引物中筛选出 5 条 多态性好，重复性高，稳定性强能够明显区别正品与伪品的引物，扩增 出的 DNA 指纹图谱具有明显差异。4、RAPD 与 ISSR 分析广西产不同居 群鸡血藤的遗传多样性方面：筛选出的 3 条 RAPD 引物及 4 条 ISSR 引物 扩增后，共得到 198 和 315 个位点，多态性位点 37、80 个，多态性位点 比率 18.7%、25.4%，有效等位基因数为 1.4168、1.5840，基因多样性指 数为 0.2694、0.3513，Shannon 多样性指数为 0.4316、0.5299，ISSR 标记 均高于 RAPD 标记，显然，ISSR 标记检测多样性的能力更高。ISSR 和 RAPD 的平均遗传相似系数为 0.75764、0.68380，ISSR 标记小于 RAPD 标记，表明 ISSR 检测遗传多样性更灵敏。通过 Ntsys 软件构建的 RAPD 和 ISSR 的聚类图看出，二者的聚类结果相近。且 SPSS17.0 软件的双变 量相关分析(Bivariate) 法对两种标记的遗传相似系数矩阵进行相关分析 得出，两者的相关系数 r=0.847，为极显著水平，表明结果的相似性。结 论 ：ISSR 标记方法可用来作为鉴别鸡血藤与其混伪品的手段，为 鸡血藤与其混伪品在分子水平上的鉴定提供依据。比 RAPD 标记反映出 更多的遗传多样性信息，更适合于广西产不同居群鸡血藤的遗传多样性 研究。关键词：鸡血藤；ISSR；真伪鉴别；遗传多样性STUDY ON GENETIC DIVERSITY AND IDENTIFICATION OF CAULIS SPATHOLOBI AND ITS ADULTERANTS IN GUANGXIABSTRACTObjective: To carry out the ISSR fingerpri