结核杆菌两个毒力因子cfp-10和esat-6协同对宿主细胞的影响及其机制研究-study on the synergistic effect of two virulence factors cfp - 10 and esat - 6 of mycobacterium tuberculosis on host cells and its mechanism.docx

The Effect and Mechanisms of Mycobacterium Tuberculosis CFP-10 and ESAT-6 Collaborative On the Host CellA Dissertation Submitted toShihezi UniversityIn Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree ofMaster of MedicalByWang Shuang(Pathogen Biology Science)Dissertation Supervisor: Prof. Cao XudongJune, 2015石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除 文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究 做出重要贡献的个人和集体 ，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名 :L 爽时间 :νI? 年j 月 7 日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定 ，学校有权保留学位论文并向国家主 管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。 有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编 出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名:L 炎导师签名 :飞机才飞时间 : 严( 年 j 月 ? 日时间 :μ() 年4 月斗日中文摘要结核分枝杆菌在宿主细胞内长期寄生可以引起结核病。小分子分泌蛋白 CFP-10 和 ESAT-6 是结核分枝杆菌的毒力因子，在结核分枝杆菌感染和致病的过程中发挥了 重要作用。在结核分枝杆菌感染宿主寄生于胞内的过程中，结核分枝杆菌的两个毒力 因子 CFP-10 和 ESAT-6 在宿主细胞中发挥作用的机制仍不清楚。本课题组前期构建了 CFP-10-PEGFP-N1 和 ESAT-6-PEGFP-N1 真核表达载体，分别转染真核细胞，初步观 察了两个毒力因子单独作用对宿主细胞凋亡的影响。 目的：在前期研究的基础上，本实验采用基因工程技术构建了荷有红色荧光报告基因 的 CFP-10-PDsRed1-N1，与荷有绿色荧光报告基因的 ESAT-6-PEGFP-N1 共同转染真 核细胞，获得 CFP-10 基因和 ESAT-6 基因在同一细胞内表达的细胞模型，进而初步探 讨结核分枝杆菌毒力因子 CFP-10、ESAT-6 协同对细胞凋亡相关基因表达的影响。 方法：双酶切 CFP-10-PEGFP-N1 真核重组表达质粒，获得 CFP-10 基因片段，将 CFP-10 基 因 插 入 PDsRed1-N1 真 核 表 达 载 体 ， 构 建 含 有 红 色 荧 光 报 告 基 因 的 CFP-10-PDsRed1-N1 真核重组表达载体。按照以下分组形式：PEGFP-N1 组PDsRed1-N1 组PEGFP-N1 和 PDsRed1-N1 双转染组CFP-10-PDsRed1-N1 组ESAT-6-PEGFP-N1 组CFP-10-PDsRed1-N1 和 ESAT-6-PEGFP-N1 双转染组7.脂质体组8.空白对照组采用脂质体方法转染 293FT 细胞，通过倒置荧光显微镜观察转染后细胞出现的荧 光情况，用 Western Blot 方法检测转染后细胞内 CFP-10 蛋白和 ESAT-6 蛋白的表达状 况，利用激光共聚焦显微技术观察分析转染后的细胞中 CFP-10 蛋白和 ESAT-6 蛋白共 定位的情况。用实时定量 PCR 技术检测四个凋亡相关基因 Bcl-2、Bax、Caspase-8、 Caspase-3 在转染前后细胞内的动态表达情况。结果：构建获得了序列正确的 CFP10-PDsRed1-N1 真核重组表达载体；获得了结核分 枝杆菌两个毒力因子 CFP-10 基因和 ESAT-6 基因共同表达的真核细胞模型，通过倒置 荧光 显微 镜观 察， 发现 转染 后的 293FT 细胞 能够 分别 发出 红色 荧光 和绿 色荧 光； Western Blot 检测结果证实融合蛋白 PDSRED-CFP-10 和 PEGFP-ESAT-6 在转染的细 胞中 获得 表达， 通过 激光共 聚焦 显微技 术观 察，又 发现 转染空 质粒 PEGFP-N1 和 PDsRed1-N1 组 293FT 细胞的红色荧光和绿色荧光主要分布在细胞质中，经 merge 后 在细胞的一部分区域的红色荧光和绿色荧光叠加为黄色，另外一部分区域仍保持红色 荧 光 ， 提 示 红 色 荧