金丽假交替单胞菌jg1抑菌机理分析-analysis of bacteriostasis mechanism of alternaria jinli jg1.docxVIP

金丽假交替单胞菌 JG1 抑菌机理研究摘要假交替单胞菌（Pseudoalteromonas）广泛分布于世界各地的海洋环境中，可 分为产色素或不产色素两大类，其中产色素菌株的显著特征是能够形成具有多种 不同生物活性的代谢产物，如抗细菌、抗真菌、溶藻等活性。目前已从该属菌株 中分离纯化出多种具有抑菌活性的小分子化合物、蛋白质、多糖等物质，而对该 属菌株基因组的分析也已成为研究其多种生物活性物质产生机制及对不同海洋 环境适应性的重要手段。因此，对该属菌株抑菌机理的研究有助于开发新型的有 益菌制剂和海洋药物，从而广泛应用于水产养殖病害、生物污损及赤潮等的防治 中。本论文分离纯化了金丽假交替单胞菌（Pseudoalteromonas flavipulchra）JG1 所产生的多种抑菌物质并对其抑菌机理进行了初步探讨，完成了该菌株的全基因 组测序及分析，并对其适应复杂的海洋环境并形成生存优势的能力进行了阐释， 为后续对该菌株及其代谢产物的开发利用奠定了理论基础。金丽假交替单胞菌 JG1 分离自健康大菱鲆养殖海水，对多个种属的菌株具 有较强的抑菌活性，如弧菌属、芽孢杆菌属等。通过石油醚﹑乙酸乙酯﹑正丁醇 对 JG1 发酵液上清和菌体样品进行分步萃取，发现菌株 JG1 发酵液的石油醚层、 乙酸乙酯层萃取样品及水层样品均具有抑菌活性。这表明 JG1 的抑菌物质中既 含有某些小分子物质如脂类、糖类、色素类化合物，也包含有大分子蛋白类物质， 这两类物质协同作用产生更好的抑菌效果。采用硫酸铵沉淀法、SDS及电洗脱法对 JG1 的胞外蛋白进行了分离 纯化，在 SDS中可见单一条带，且胶内活性检测表明该蛋白对鳗弧菌有 较强的抑菌活性。将此抑菌蛋白经 De novo 测序得到的两条肽段的氨基酸序列与 菌株 JG1 的蛋白质组序列进行比对，获得其基因及氨基酸序列全长，并将其命 名为 PfaP。PfaP 蛋白共由 694 个氨基酸组成，理论分子量为 77.0 kDa，理论等 电点为 4.63，Signal P 预测其不含有信号肽序列。氨基酸序列比对结果显示，PfaP 蛋白与被囊假交替单胞菌（P. tunicata）D2 的 L-赖氨酸氧化酶 AlpP 具有 58%的 一致性，与地中海海洋单胞菌（Marinomonas mediterranea）MMB-1 的抗微生物 蛋白 marinocine 具有 54%的一致性。由此推测 PfaP 蛋白为一种 L-氨基酸氧化酶， 其抑菌活性是由过氧化氢介导的，过氧化氢酶能够抑制其抑菌活性的产生。对 PfaP 蛋白的基因序列进行克隆，并分别与表达载体 pET 24a(+)、pET26b(+)、pET 32a(+)、pBAD/Myc-HisB 及 pRSFDuet-1 连接，构建了重组表达菌 株 Escherichia coli BL21/pET 24a(+)/PfaP、E. coli BL21/pET 26b(+)/PfaP、E. coli BL21/pET 32a(+)/PfaP、E. coli BL21/pBAD/Myc-HisB/PfaP 以及 E. coli BL21/ pRSFDuet-1/PfaP，并在体外诱导表达。PfaP 蛋白能够在大肠杆菌中得到异源表 达，但可能由于在大肠杆菌中无法对该蛋白进行正确的翻译后修饰，其异源表达 产物不能够形成有活性的成熟蛋白。菌株 JG1 的乙酸乙酯萃取物经多步硅胶柱层析及半制备反相高效液相色谱 分析，共分离得到 5 种具有抑菌活性的单体小分子化合物，分别为对羟基苯甲酸（1）、反式桂皮酸（2）、6-溴吲哚-3-乙酸（3）、N-羟基苯并异恶唑酮（4）和 2- 脱氧腺苷（5）。其中，仅带有一个溴原子的化合物 3 为黄褐色，稀释后呈鲜艳黄 色，推测其为菌株 JG1 形成的一种色素分子，使菌落呈现金黄色。这 5 种小分 子化合物对鳗弧菌均具有抑菌活性，微量稀释法检测最小抑菌浓度分别为 1.25、 1.25、0.25、0.25 和 5 mg/ml。化合物 3 的抑菌活性最强，抑菌范围也最广，对 革兰氏阳性菌和阴性菌均具有抑菌活性。由此可见，色素分子与抑菌蛋白的协同 作用使菌株 JG1 表现出良好的抑菌活性。这 5 种小分子化合物均首次发现能对 海水养殖病原菌产生抑制活性。采用 Illumina 高通量测序技术对 JG1 的全基因组进行了测序及分析，共预测 得到 4913 个基因，总长度为 4,828,917bp，占基因组的 87.71%。同时，在 JG1 基因组中发现预测的 104 个 tRNA 编码基因和 4 个 rRNA 操纵子。与已知基因组 序列的被囊假交替单胞菌（P. tunicata）D2、游海假交替单胞菌（P. haloplanktis） TAC125、大西洋假交替单胞菌（