利用crisprcas9和crelox系统构建伪狂犬病毒双基因缺失活疫苗-construction of pseudorabies virus double-gene deleted live vaccine by using crisprcas 9 and cre lox system.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文3．2．11细胞培养223．2．12细胞PEI转染223．2．13低熔点琼脂糖挑斑纯化223．2．14病毒的增殖、收获和保存233．2．15病毒基因组DNA提取．233．2．16测定病毒半数组织感染量(TCID50)243．2．17小鼠动物实验243．2．18仔猪动物实验24第四章结果与分析．254．1质粒载体的构建和鉴定254．1．1guideRNA的设计和表达载体构建和鉴定254．1．2TK、gE基因重组同源臂构建264．2利用CRISPR／Cas9系统构建PRV-ATK—AgE—mCherry—GFP重组毒．274．3PRV-HNX-ATK—AgE—mCherry-GFP重组毒的纯化．284．3．1PRV-HNX-ATK-agE-mCherry-GFP重组毒的单细胞流式分选纯化284．3．2PRV-HNX—ATK—AgE—mCherry—GFP重组病毒的低熔点琼脂糖噬斑纯化294．4PRV-HNX-ATK-AgE-mCherry—GFP重组病毒的鉴定．．294．5利用Cre／lox系统敲除PRV-HNX—ATK—AgE—mCherry．GFP荧光基因．304．6PRV-HNX—ATK—AgE的纯化和鉴定．3l4．7小鼠动物实验324．7．1小鼠攻毒实验．324．7．2小鼠免疫实验．334．8仔猪动物实验344．9讨论．：；64．9．1sgRNA的设计．364．9．2同源重组片段的设计、扩增和融合．364．9．3细胞转染和病毒感染条件的摸索．374．9．4伪狂犬病毒TK基因抑制剂BVDU的使用．374．9．5单细胞流式分选在重组病毒分选中的应用．374．9．6CRISPR／Cas9编辑病毒基因组。384．9．7病毒传染性疾病的防治和病毒的变异进化．．384．9．8CRISPR／Cas9和Cre／Iox基因编辑系统在疫苗制备中的潜力394．9．9PRV基因缺失毒株的应用。39第五章结论．41参考文献42附录．48至定谢．49II万方数据利用c砒sP眦豁9和Crenox系统构建伪狂犬病毒双基因缺失活疫苗摘要伪狂犬病毒是伍一疱疹病毒属成员，基因组由150kb左右的DNA双链构成。伪狂犬病毒感染猪只后会诱发宿主严重的传染性疾病，给全世界生猪养殖产业带来了巨大经济损失。虽然长期以来伪狂犬病毒疫苗得到了广泛应用并很好地控制了该病的流行，但近年来伪狂犬病突然在我国经过疫苗免疫的猪场爆发并在全国范围内流行，成为目前我国生猪养殖业面临的最大危害之一，这表明传统疫苗失去了对伪狂犬病的免疫保护作用，更多研究报道也进一步说明该病毒的基因组或主要抗原基因己经发生变异。传统制备伪狂犬病毒多基因缺失活疫苗的方法需要逐步敲除多个毒力基因，并经过共几十轮的低熔点琼脂糖空斑纯化，耗时耗力。因此亟需更高效经济的病毒疫苗制备策略来应对变异毒株的爆发和流行等问题。本课题构建了基于CRISPR／C嬲9和Credox基因编辑系统的快速制备伪狂犬病毒双基因缺失活疫苗的新方法，同步敲除伪狂犬病毒变异毒株PRV-HNX的TK和gE两个毒力基因，成功制备了伪狂犬病毒双基因缺失活疫苗侯选株，对当下流行的伪狂犬病有较好的免疫保护作用。主要步骤概括如下：一，利用CⅪSP刚CaS9和同源重组修复机制同时将绿色荧光蛋白(GFP)和红色荧光蛋白(mCherry)分别重组到PRV-HNX基因组gE和TK基因位点。二，利用单细胞流式分选和低熔点琼脂糖挑斑纯化得到PRV-AgE—ATK—GFP+mCherry重组毒。提取重组毒基因组DNA，PCR鉴定重组病毒是否纯化。三，再利用Creflox重组系统将重组病毒基因组中GFP和mCherry基因敲除。再利用低熔点琼脂糖噬斑纯化PRV-HNX．ATK．AgE双基因缺失毒株，并提取病毒基因组DNA进行PCR鉴定是否为所需重组病毒。四，分别用小鼠和仔猪进行PRV-HNX．ATK．AgE毒株免疫保护实验。表明PRV-HNX—AgE．ATK毒株对我国新近流行的伪狂犬病毒有很好的免疫保护作用，可以作为防控伪狂犬疫苗侯选株。关键词：伪狂犬病毒；CRISPR／C嬲9；Credox：基因缺失活疫苗万方数据华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文AbstractPseudorabiesvirus(PRV)isamemberofthealphaherpesvirinaesubfamily．PRVgenomeconstitutesapproximately150KDNAdoublestrand．PRVinfectioncausingpseudorabiesisoneofthemostdevastatingswineinfectiousdiseasesintheswineindustryworldwide．Insp“