生物技术知识第六章－分子标记优化.ppt

* 园艺植物生物技术 * Hybridization based Marker-RFLP 性质： RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism)是DNA-DNA杂交的分子标记。 原理:这种多态性是由于限制性酶切位点或位点附近的DNA区域发生变异所引起的。 * 园艺植物生物技术 * PCR常见问题之三 拖尾 现象：产物在凝胶上呈Smear状态。 M 1 2 * 园艺植物生物技术 * PCR常见问题之三 模板不纯 Buffer不合适 退火温度偏低 酶量过多 dNTP、Mg2+浓度偏高 循环次数过多 原因 对 策 纯化模板 更换Buffer 适当提高退火温度 适量用酶 适当降低dNTP和镁离子的浓度 减少循环次数 拖尾 * 园艺植物生物技术 * PCR常见问题之四 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况) 原因：靶序列或扩增产物的交叉污染 现象：空白对照出现目的扩增产物 对策： 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外； 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及加样枪头等均应一次性使用。 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。 * 园艺植物生物技术 * 巢式PCR（Nest-PCR） 四种策略 递减PCR（TouchDown PCR） 热启动PCR（HotStart PCR） 使用PCR增强剂 * 园艺植物生物技术 * 策略之一 巢式PCR（Nest-PCR） P1 P2 P3 P4 巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。 巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5 RACE）的特异性。 * 园艺植物生物技术 * 策略之二 递减PCR（TouchDown PCR） 递减PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的Tm高大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1-2℃,直到退火温度低于Tm 5℃。 特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。 递减PCR对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如AFLP、DNA指纹分析等。 * 园艺植物生物技术 * 策略之三 热启动PCR （HotStart PCR） 热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟DNA合成，直到PCR 仪达到变性温度； 现在有很多公司都有HotStart Taq酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用； 热启动PCR是除了好的引物设计之外，提高PCR特异性最重要的方法之一。 * 园艺植物生物技术 * 策略之四 使用PCR增强剂 甲酰胺，DMSO，甘油，甜菜碱等都可充当PCR的增强剂。 其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助DNA聚合酶延伸通过二级结构区。 增强剂浓度要适当 从定性到定量的革命 * 园艺植物生物技术 * PCR产物生成曲线 log[DNA] Cycles * 园艺植物生物技术 * PCR 琼脂糖凝胶电泳 最终产物 紫外光观察 3-4 小时 * 园艺植物生物技术 * PCR具有极高的灵敏度 样品 正对照 负对照 标准分子量 污染是PCR实验的常见问题。只要实验室里曾经扩增过某个片段，就有可能以后的实验中发生污染。 因此，做实验的时候绝对不要忘了负对照。 用紫外灯破坏污染物也是一个办法 * 园艺植物生物技术 * log[DNA] Cycles 不同样品有不同的生成曲线 * 园艺植物生物技术 * 普通PCR和定量PCR的区别 适用定性分析，不适合定量分析； PCR 产物的长度从100bp －数kb 实时检测:每个循环都产出荧光信号 绝对定量，灵敏度更高 PCR产物的长度一般在 60-150 bps * 园艺植物生物技术 * 定量PCR相关的近年来国际学术刊物上发表的论文数 1996 1997 1998 1999 2000 2003年已经达到3000篇 * 园艺植物生物技术 * Real-Time PCR，SYBR green Cycle 1 Cycle 3 Cycle 2 Molecular Probe公司的一个专利产品， US Patent 5,436,134 1993年7月12日申请 * 园艺植物生物技术 * SYBR green 的优缺点 简便 可以使用已有的引物 普遍通用 可以检测所有的双链DNA，包括引物二聚体； 需要化大力气优化反应条件，以消除非特异性扩增； 价格 $1 / PCR 反应 定量的灵敏